Täname, et külastasite veebilehte Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Toxoplasma gondii on rakusisene algloomade parasiit, mis moduleerib nakatunud peremeesorganismi mikrokeskkonda ja on teadaolevalt seotud ajukasvaja kasvu esinemissagedusega.Selles uuringus oletame, et Toxoplasma nakkuse eksosomaalne miRNA-21 soodustab ajukasvaja kasvu.Iseloomustati toksoplasmaga nakatunud BV2 mikroglia eksosoome ja kinnitati U87 glioomirakkude sisestamine.Eksosomaalseid mikroRNA ekspressiooniprofiile analüüsiti, kasutades Toxoplasma gondii ja kasvaja sorteerimisega seotud mikroRNA ja mikroRNA-21A-5p massiive.Uurisime ka kasvajaga seotud geenide mRNA taset U87 glioomirakkudes, muutes miR-21 taset eksosoomides ja eksosoomide mõju inimese U87 glioomirakkude proliferatsioonile.Toxoplasma gondii'ga nakatunud U87 glioomirakkude eksosoomides suureneb mikroRNA-21 ekspressioon ja väheneb kasvajavastaste geenide (FoxO1, PTEN ja PDCD4) aktiivsus.Toksoplasmaga nakatunud BV2-st pärinevad eksosoomid kutsuvad esile U87 glioomirakkude proliferatsiooni.Eksosoomid indutseerivad U87 rakkude kasvu hiire kasvaja mudelis.Soovitame, et suurenenud eksosomaalne miR-21 toksoplasmaga nakatunud BV2 mikroglias võib mängida olulist rolli rakkude kasvu promootorina U87 glioomirakkudes, vähendades kasvajavastaseid geene.
Hinnanguliselt diagnoositi 2018. aastal maailmas enam kui 18,1 miljonit kaugelearenenud vähijuhtu, kusjuures igal aastal diagnoositakse ligikaudu 297 000 kesknärvisüsteemi kasvajat (1,6% kõigist kasvajatest)1.Varasemad uuringud on näidanud, et inimese ajukasvajate tekke riskifaktoriteks on erinevad keemiatooted, perekonna ajalugu ja pea ravi- ja diagnostikaseadmete ioniseeriv kiirgus.Nende pahaloomuliste kasvajate täpne põhjus pole aga teada.Ligikaudu 20% kõigist vähkkasvajatest maailmas on põhjustatud nakkusetekitajatest, sealhulgas viirustest, bakteritest ja parasiitidest3,4.Nakkuslikud patogeenid häirivad peremeesraku geneetilisi mehhanisme, nagu DNA parandamine ja rakutsükkel, ning võivad põhjustada kroonilist põletikku ja immuunsüsteemi kahjustusi5.
Inimese vähiga seotud nakkusetekitajad on kõige levinumad viiruspatogeenid, sealhulgas inimese papilloomiviirused ning B- ja C-hepatiidi viirused.Parasiidid võivad samuti mängida potentsiaalset rolli inimese vähi tekkes.Mitmed parasiidiliigid, nimelt Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ja Hymenolepis nana, on seotud inimese erinevat tüüpi vähiga 6, 7, 8.
Toxoplasma gondii on rakusisene algloom, mis reguleerib nakatunud peremeesrakkude mikrokeskkonda.See parasiit nakatab hinnanguliselt umbes 30% maailma elanikkonnast, seades ohtu kogu elanikkonna9,10.Toxoplasma gondii võib nakatada elutähtsaid organeid, sealhulgas kesknärvisüsteemi (KNS) ja põhjustada tõsiseid haigusi, nagu surmaga lõppev meningiit ja entsefaliit, eriti immuunpuudulikkusega patsientidel9.Kuid Toxoplasma gondii võib muuta ka nakatunud peremeesorganismi keskkonda, moduleerides rakkude kasvu ja immuunvastuseid immunokompetentsetel inimestel, mis viib asümptomaatilise kroonilise infektsiooni säilimiseni9,11.Huvitav on see, et arvestades korrelatsiooni T. gondii levimuse ja ajukasvaja esinemissageduse vahel, viitavad mõned aruanded sellele, et kroonilise T. gondii infektsiooni tõttu toimuvad peremeesorganismi keskkonnamuutused in vivo meenutavad kasvaja mikrokeskkonda.
Eksosoome tuntakse rakkudevaheliste kommunikaatoritena, mis edastavad naaberrakkudest bioloogilist sisu, sealhulgas valke ja nukleiinhappeid16, 17.Eksosoomid võivad mõjutada kasvajaga seotud bioloogilisi protsesse, nagu anti-apoptoos, angiogenees ja metastaasid kasvaja mikrokeskkonnas.Eelkõige on miRNA-d (miRNA-d), väikesed umbes 22 nukleotiidi pikkused mittekodeerivad RNA-d, olulised transkriptsioonijärgsed geeniregulaatorid, mis kontrollivad enam kui 30% inimese mRNA-st miRNA-indutseeritud vaigistamiskompleksi (miRISC) kaudu.Toxoplasma gondii võib häirida bioloogilisi protsesse, kontrollides miRNA ekspressiooni nakatunud peremeesorganismides.Peremeesorganismi miRNA-d sisaldavad olulisi signaale peremeesorganismi bioloogiliste protsesside reguleerimiseks, et saavutada parasiidi ellujäämisstrateegia.Seega võib peremeesorganismi miRNA profiili muutuste uurimine pärast nakatumist T. gondii'ga aidata meil selgemalt mõista peremeesorganismi ja T. gondii vahelist koostoimet.Tõepoolest, Thirugnanam et al.15 väitis, et T. gondii soodustab aju kantserogeneesi, muutes selle ekspressiooni spetsiifilistel peremeesorganismi miRNA-del, mis on seotud kasvaja kasvuga, ja leidis, et T. gondii võib katseloomadel põhjustada glioome.
See uuring keskendub eksosomaalse miR-21 muutumisele Toxoplasma BV2-ga nakatunud peremeesorganismis.Me täheldasime muutunud eksosomaalse miR-21 võimalikku rolli U87 glioomirakkude kasvus, mis on tingitud FoxO1 / p27 tuumas peetusest, mis on üleekspresseeritud miR-21 sihtmärk.
BV2-st saadud eksosoomid saadi diferentsiaalse tsentrifuugimise abil ja valideeriti erinevate meetoditega, et vältida saastumist rakuliste komponentide või muude vesiikulitega.SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE) näitas erinevaid mustreid BV2 rakkudest ekstraheeritud valkude ja eksosoomide vahel (joonis 1A) ning proovides hinnati Alixi olemasolu, mida analüüsiti eksosomaalsete valgumarkerite Western blot analüüsiga .Alix-märgistust leiti eksosoomivalkudes, kuid mitte BV2 rakulüsaatvalkudes (joonis 1B).Lisaks analüüsiti bioanalüsaatori abil puhastatud RNA-d BV2-st saadud eksosoomidest.18S ja 28S ribosomaalseid subühikuid täheldati eksosomaalses RNA migratsioonimustris harva, mis näitab usaldusväärset puhtust (joonis 1C).Lõpuks näitas ülekandeelektronmikroskoopia, et täheldatud eksosoomid olid umbes 60–150 nm suurused ja neil oli eksosoomi morfoloogiale tüüpiline tassilaadne struktuur (joonis 1D).
BV2 rakkudest pärinevate eksosoomide iseloomustus.(A) Ohutuskaardi leht.Valgud eraldati BV2 rakkudest või BV2-st tuletatud eksosoomidest.Valgu mustrid on rakkude ja eksosoomide vahel erinevad.(B) Eksosomaalse markeri (Alix) Western blot analüüs.(C) BV2 rakkudest ja BV2-st saadud eksosoomidest pärit puhastatud RNA hindamine bioanalüsaatori abil.Seega leiti 18S ja 28S ribosomaalseid subühikuid BV2 rakkudes eksosomaalses RNA-s harva.(D) Edastuselektronmikroskoopia näitas, et BV2 rakkudest eraldatud eksosoomid värviti negatiivselt 2% uranüülatsetaadiga.Eksosoomid on umbes 60–150 nm suurused ja tassikujulised (Song ja Jung, avaldamata andmed).
BV2-st pärinevate eksosoomide rakkude sisestamist U87 inimese glioomirakkudesse täheldati konfokaalse mikroskoopia abil.PKH26 märgistatud eksosoomid paiknevad U87 rakkude tsütoplasmas.Tuumad värviti DAPI-ga (joonis 2A), mis näitab, et BV2-st pärinevad eksosoomid võivad peremeesrakud sisestada ja mõjutada retsipientrakkude keskkonda.
BV2-st pärinevate eksosoomide sisestamine U87 glioomirakkudesse ja Toxoplasma RH-ga nakatunud BV2-st saadud eksosoomid kutsus esile U87 glioomirakkude proliferatsiooni.(A) U87 rakkude poolt haaratud eksosoomid, mõõdetuna konfokaalse mikroskoopia abil.U87 glioomirakke inkubeeriti 24 tundi PKH26-ga (punane) või ilma kontrollita märgistatud eksosoomidega.Tuumad värviti DAPI-ga (sinine) ja seejärel vaadeldi konfokaalse mikroskoobi all (skaala riba: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioomirakkude proliferatsioon määrati rakkude proliferatsiooni testiga.U87 glioomirakke töödeldi näidatud aja jooksul eksosoomidega. *P < 0,05 saadi Studenti t-testiga. *P < 0,05 saadi Studenti t-testiga. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 Studenti t-testi järgi. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, saadud Studenti t-testi abil.
Pärast BV2-st pärinevate eksosoomide sisestamise kinnitamist U87 glioomirakkudesse viisime läbi rakkude proliferatsiooni testid, et uurida BV2-st pärinevate toksoplasmast pärinevate eksosoomide rolli inimese glioomirakkude arengus.U87 rakkude töötlemine T. gondii-ga nakatunud BV2 rakkude eksosoomidega näitas, et T. gondii-ga nakatunud BV2-st pärinevad eksosoomid põhjustasid U87 rakkude oluliselt suurema proliferatsiooni võrreldes kontrolliga (joonis 2B).
Lisaks oli U118 rakkude kasvul samad tulemused kui U87-l, kuna toksoplasma stimuleeritud eksosoomid põhjustasid kõrgeima proliferatsiooni taseme (andmeid pole näidatud).Nende andmete põhjal võime näidata, et BV2-st pärinevad toksoplasmaga nakatunud eksosoomid mängivad olulist rolli glioomirakkude proliferatsioonis.
Toksoplasmaga nakatunud BV2-st pärinevate eksosoomide mõju uurimiseks kasvaja arengule süstisime U87 glioomirakud karvututele hiirtele ksenotransplantaadi mudeli jaoks ja süstisime BV2-st pärinevaid eksosoome või RH-ga nakatunud BV2-st pärinevaid eksosoome.Pärast seda, kui kasvajad ilmnesid 1 nädala pärast, jagati iga 5 hiirest koosnev katserühm kasvaja suuruse järgi, et määrata sama lähtepunkt, ja kasvaja suurust mõõdeti 22 päeva.
U87 ksenotransplantaadi mudeliga hiirtel täheldati BV2-st pärineva RH-ga nakatunud eksosoomirühmas 22. päeval oluliselt suuremat kasvaja suurust ja kaalu (joonis 3A, B).Teisest küljest ei olnud pärast eksosoomiravi BV2-st saadud eksosoomirühma ja kontrollrühma vahel kasvaja suuruses olulist erinevust.Lisaks oli glioomirakkude ja eksosoomidega süstitud hiirtel visuaalselt suurim kasvaja maht RH-ga nakatunud BV2-st pärinevate eksosoomide rühmas (joonis 3C).Need tulemused näitavad, et BV2-st pärinevad toksoplasmaga nakatunud eksosoomid kutsuvad esile glioomi kasvu hiire kasvaja mudelis.
BV2-st pärinevate eksosoomide onkogenees (AC) U87 ksenotransplantaadi hiiremudelis.Kasvaja suurus (A) ja kaal (B) suurenesid märkimisväärselt BALB/c karvututel hiirtel, keda raviti BV2-st saadud RH-ga nakatunud eksosoomidega.BALB/c karvututele hiirtele (C) süstiti subkutaanselt 1 x 107 U87 rakku, mis oli suspendeeritud Matrigeli segus.Kuus päeva pärast süstimist töödeldi hiirtel 100 μg BV2-st pärinevaid eksosoome.Kasvaja suurust ja kaalu mõõdeti vastavalt näidatud päevadel ja pärast surmamist. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Andmed näitasid, et 37 miRNA-d (16 üleekspresseeritud ja 21 allaekspresseeritud), mis olid seotud immuunsuse või kasvaja arenguga, olid pärast Toxoplasma RH tüvega nakatumist oluliselt muutunud (joonis 4A).MiR-21 suhtelised ekspressioonitasemed muudetud miRNA-de seas kinnitati reaalajas RT-PCR abil BV2-st tuletatud eksosoomides, BV2 ja U87 rakkudega töödeldud eksosoomides.MiR-21 ekspressioon näitas Toxoplasma gondii (RH tüvi) nakatunud BV2 rakkude eksosoomide olulist suurenemist (joonis 4B).MiR-21 suhtelised ekspressioonitasemed BV2 ja U87 rakkudes suurenesid pärast muutunud eksosoomide omastamist (joonis 4B).MiR-21 ekspressiooni suhteline tase kasvajapatsientide ja Toxoplasma gondii'ga (ME49 tüvi) nakatunud hiirte ajukoes oli vastavalt kõrgem kui kontrollidel (joonis 4C).Need tulemused korreleeruvad erinevustega prognoositud ja kinnitatud mikroRNA-de ekspressioonitasemete vahel in vitro ja in vivo.
Muutused eksosomaalse miP-21a-5p ekspressioonis Toxoplasma gondii'ga (RH) nakatunud mikroglias.(A) Näitab olulisi muutusi siRNA-s, mis on seotud immuunsuse või kasvaja arenguga pärast T. gondii RH infektsiooni.(B) Suhtelised miR-21 ekspressioonitasemed tuvastati reaalajas RT-PCR abil BV2-st tuletatud eksosoomides, BV2-ga töödeldud eksosoomides ja U87 rakkudes.(C) Suhtelised miR-21 ekspressioonitasemed leiti kasvajapatsientide (N=3) ja Toxoplasma gondii-ga (ME49 tüvi) (N=3) nakatunud hiirte ajukoes. *P < 0,05 saadi Studenti t-testiga. *P < 0,05 saadi Studenti t-testiga. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 saadi Studenti t-testi abil. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, saadud Studenti t-testi abil.
RH-ga nakatunud BV2 rakkude eksosoomid põhjustasid glioomide kasvu in vivo ja in vitro (joonis 2, 3).Asjakohaste mRNA-de tuvastamiseks uurisime kasvajavastaste sihtgeenide, kahvlipea kasti O1 (FoxO1), PTEN ja programmeeritud rakusurma 4 (PDCD4) mRNA tasemeid U87 rakkudes, mis olid nakatunud BV2 või RH BV2 eksosoomidega.Bioinformaatika analüüs on näidanud, et mitmetel kasvajaga seotud geenidel, sealhulgas geenidel FoxO1, PTEN ja PDCD4, on miR-2121,22 sidumissaidid.Tuumorivastaste sihtgeenide mRNA tasemed vähenesid RH-ga nakatunud BV2-st pärinevates eksosoomides võrreldes BV2-st pärinevate eksosoomidega (joonis 5A).FoxO1 näitas RH-ga nakatunud BV2-st pärinevates eksosoomides vähenenud valgu taset võrreldes BV2-st pärinevate eksosoomidega (joonis 5B).Nende tulemuste põhjal võime kinnitada, et RH-ga nakatunud BV2-st pärinevad eksosoomid reguleerivad alla onkogeenseid geene, säilitades nende rolli kasvaja kasvus.
Toxoplasma RH-ga nakatunud BV2-st pärinevad eksosoomid kutsuvad esile kasvajavastaste geenide supressiooni U87 glioomirakkudes Toxoplasma RH-ga nakatunud BV2-st pärinevate eksosoomide poolt.(A) FoxO1, PTEN ja PDCD4 ekspressiooni reaalajas PCR T. gondii RH-ga nakatunud BV2-st saadud eksosoomides võrreldes PBS-i eksosoomidega.Kontrollina kasutati β-aktiini mRNA-d.(B) FoxO1 ekspressioon määrati Western blot analüüsiga ja densitomeetria andmeid hinnati statistiliselt ImageJ programmi abil. *P < 0,05 saadi Studenti t-testiga. *P < 0,05 saadi Studenti t-testiga. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 saadi Studenti t-testi abil. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, saadud Studenti t-testi abil.
Et mõista miP-21 mõju eksosoomides kasvajaga seotud geeniregulatsioonile, transfekteeriti U87 rakud miP-21 inhibiitoriga, kasutades Lipofectamine 2000 ja rakud koguti 24 tundi pärast transfektsiooni.FoxO1 ja p27 ekspressioonitasemeid miR-21 inhibiitoritega transfekteeritud rakkudes võrreldi qRT-PCR abil BV2-st pärinevate eksosoomidega töödeldud rakkudega (joonis 6A, B).MiR-21 inhibiitori transfektsioon U87 rakkudesse vähendas oluliselt FoxO1 ja p27 ekspressiooni (joonis fig 6).
RH-ga nakatunud eksosomaalne BV2-st tuletatud miP-21 muutis FoxO1 / p27 ekspressiooni U87 glioomirakkudes.U87 rakud transfekteeriti miP-21 inhibiitoriga, kasutades Lipofectamine 2000 ja rakud koguti 24 tundi pärast transfektsiooni.FoxO1 ja p27 ekspressioonitasemeid miR-21 inhibiitoritega transfekteeritud rakkudes võrreldi qRT-PCR abil (A, B) BV2-st pärinevate eksosoomidega töödeldud rakkude tasemetega.
Peremeesorganismi immuunvastuse eest põgenemiseks muundub Toxoplasma parasiit koetsüstiks.Nad parasiteerivad erinevates kudedes, sealhulgas ajus, südames ja skeletilihastes, kogu peremeesorganismi eluea jooksul ning moduleerivad peremeesorganismi immuunvastust.Lisaks saavad nad reguleerida peremeesrakkude rakutsüklit ja apoptoosi, soodustades nende proliferatsiooni14,24.Toxoplasma gondii nakatab valdavalt peremees-dendriitrakke, neutrofiile ja monotsüütide/makrofaagide liini, sealhulgas aju mikrogliat.Toxoplasma gondii kutsub esile M2 fenotüübi makrofaagide diferentseerumise, mõjutab haavade paranemist pärast patogeeniga nakatumist ning on seotud ka hüpervaskularisatsiooni ja granulomatoosse fibroosiga.See toksoplasma infektsiooni käitumuslik patogenees võib olla seotud kasvaja arenguga seotud markeritega.Toxoplasma poolt reguleeritud vaenulik keskkond võib sarnaneda vastava vähieelse vähiga.Seetõttu võib eeldada, et toksoplasma infektsioon peaks kaasa aitama ajukasvajate tekkele.Tegelikult on erinevate ajukasvajatega patsientide seerumis teatatud kõrgest toksoplasma nakatumise määrast.Lisaks võib Toxoplasma gondii olla teine ​​kantserogeenne efektor ja toimida sünergistlikult, et aidata teistel nakkusohtlikel kantserogeenidel ajukasvajaid arendada.Sellega seoses väärib märkimist, et P. falciparum ja Epstein-Barri viirus aitavad sünergistlikult kaasa Burkitti lümfoomi tekkele.
Eksosoomide rolli regulaatoritena vähiuuringute valdkonnas on põhjalikult uuritud.Parasiitide ja nakatunud peremeesorganismide vaheliste eksosoomide roll on aga endiselt halvasti mõistetav.Seni on erinevad regulaatorid, sealhulgas sekreteeritud valgud, selgitanud bioloogilisi protsesse, mille abil algloomade parasiidid peavad vastu peremeesorganismi rünnakule ja püsivad infektsiooni.Viimasel ajal on levinud arusaam, et algloomadega seotud mikrovesiikulid ja nende mikroRNA-d interakteeruvad peremeesrakkudega, et luua nende ellujäämiseks soodne keskkond.Seetõttu on muutunud eksosomaalsete miRNA-de ja glioomirakkude proliferatsiooni vahelise seose avastamiseks vaja täiendavaid uuringuid.MikroRNA muutus (klastrigeenid miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ja miR-17-92) seondub toksoplasmaga nakatunud inimese makrofaagides STAT3 promootoriga, on reguleeritud ja indutseerib anti- - apoptoos vastuseks Toxoplasma gondii infektsioonile 29 .Toksoplasma infektsioon suurendab miR-17-5p ja miR-106b-5p ekspressiooni, mida seostatakse mitme hüperproliferatiivse haigusega 30 .Need andmed viitavad sellele, et Toxoplasma infektsiooni poolt reguleeritud peremeesorganismi miRNA-d on olulised molekulid parasiitide ellujäämiseks ja patogeneesiks peremeesorganismi bioloogilises käitumises.
Muudetud miRNA-d võivad mõjutada erinevat tüüpi käitumist pahaloomuliste rakkude, sealhulgas glioomide initsiatsioonil ja progresseerumisel: kasvusignaalide iseseisvus, tundlikkus kasvu inhibeerivate signaalide suhtes, apoptoosi vältimine, piiramatu replikatsioonipotentsiaal, angiogenees, invasioon ja metastaasid ning põletik.Glioomi puhul on muudetud miRNA-sid tuvastatud mitmes ekspressiooniprofiili koostamise uuringus.
Käesolevas uuringus kinnitasime miRNA-21 ekspressiooni kõrget taset toksoplasmaga nakatunud peremeesrakkudes.miR-21 on tuvastatud kui üks kõige sagedamini üleekspresseeritud mikroRNA-sid tahketes kasvajates, sealhulgas glioomides, ja selle ekspressioon korreleerub glioomi astmega.Kogunev tõendusmaterjal viitab sellele, et miR-21 on uudne onkogeen, mis toimib glioomide kasvus apoptootilise tegurina ja on inimese aju pahaloomuliste kasvajate kudedes ja plasmas tugevalt üleekspresseeritud.Huvitav on see, et miR-21 inaktiveerimine glioomirakkudes ja kudedes käivitab rakkude proliferatsiooni pärssimise kaspaasist sõltuva apoptoosi tõttu.MiR-21 prognoositud sihtmärkide bioinformaatiline analüüs näitas mitmeid apoptoosi radadega seotud kasvaja supressorgeene, sealhulgas programmeeritud rakusurm 4 (PDCD4), tropomüosiin (TPM1), PTEN ja kahvlipea kast O1 (FoxO1) koos miR-2121 sidumissaidiga..22.38.
FoxO1, kui üks transkriptsioonifaktoritest (FoxO), osaleb erinevat tüüpi inimese vähi arengus ja võib reguleerida kasvaja supressorgeenide, nagu p21, p27, Bim ja FasL40, ekspressiooni.FoxO1 võib rakkude kasvu pärssimiseks siduda ja aktiveerida rakutsükli inhibiitoreid, nagu p27.Lisaks on FoxO1 PI3K / Akt signaaliülekande võtmeefektor ja reguleerib paljusid bioloogilisi protsesse, nagu rakutsükli progresseerumine ja rakkude diferentseerumine p2742 transkriptsiooni aktiveerimise kaudu.
Kokkuvõtteks usume, et toksoplasmaga nakatunud mikrogliiast tuletatud eksosomaalne miR-21 võib mängida olulist rolli glioomirakkude kasvuregulaatorina (joonis 7).Siiski on vaja täiendavaid uuringuid, et leida otsene seos eksosomaalse miR-21, muutunud toksoplasma infektsiooni ja glioomi kasvu vahel.Need tulemused peaksid olema lähtepunktiks toksoplasma nakkuse ja glioomi esinemissageduse vahelise seose uurimisel.
Selles uuringus pakutakse välja skemaatiline diagramm glioomi (aju) kantserogeneesi mehhanismi kohta.Autor joonistab programmis PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Kõik selle uuringu katseprotokollid, sealhulgas loomade kasutamine, olid kooskõlas Souli riikliku ülikooli loomade hooldamise ja kasutajate komitee standardsete eetiliste juhistega ning need kiitis heaks Souli riikliku ülikooli meditsiinikooli institutsionaalne läbivaatamisnõukogu (IRB number SNU- 150715).-2).Kõik katseprotseduurid viidi läbi vastavalt ARRIVE soovitustele.
BV2 hiire mikrogliia ja U87 inimese glioomirakke kultiveeriti vastavalt Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) ja Roswell Parki memoriaalinstituudi söötmes (RPMI; Welgene), millest igaüks sisaldas 10% veise loote seerumit, 4 mM l- glutamiini, 0,2 mM penitsilliini ja 0,05 mM streptomütsiini.Rakke kultiveeriti inkubaatoris 5% CO2-ga temperatuuril 37 °C.U87 rakkudega võrdlemiseks kasutati teist glioomi rakuliini U118.
Eksosoomide isoleerimiseks T. gondii-ga nakatunud RH- ja ME49 tüvedest koguti T. gondii tachyzoites (RH tüvi) 6-nädalaste BALB/c hiirte kõhuõõnde, kellele süstiti 3-4 päeva varem.Tahhüzoiite pesti kolm korda PBS-ga ja puhastati tsentrifuugimisega 40% Percollis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Tüve ME49 tahhüzoiitide saamiseks süstiti BALB/c hiirtele intraperitoneaalselt 20 koetsüsti ja tahhüzoiidi transformatsioon tsüstides koguti kõhuõõne pesemisega 6.–8. päeval pärast nakatumist (PI).PBS-ga nakatunud hiired.ME49 tahhüzoite kasvatati rakkudes, millele oli lisatud 100 μg/ml penitsilliini (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 µg/ml streptomütsiini (Gibco/BRL) ja 5% veise loote seerumit (Lonza, Walkersville, MD). .., USA) temperatuuril 37 °C ja 5% süsinikdioksiidiga.Pärast kasvatamist Vero rakkudes lasti ME49 tahhüzoiidid kaks korda läbi 25 gauge nõela ja seejärel läbi 5 µm filtri, et eemaldada praht ja rakud.Pärast pesemist resuspendeeriti tahhüsoidid PBS44-s.Toxoplasma gondii tüve ME49 koetsüstid säilitati nakatunud C57BL/6 hiirte ajust eraldatud tsüstide intraperitoneaalse süstimisega (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).ME49-ga nakatunud hiirte ajud koguti pärast 3-kuulist PI-d ja hakiti mikroskoobi all tsüstide isoleerimiseks.Nakatunud hiiri hoiti Souli riiklikus ülikooli meditsiinikoolis spetsiaalsetes patogeenivabades tingimustes (SPF).
Kogu RNA ekstraheeriti BV2-st pärinevatest eksosoomidest, BV2 rakkudest ja kudedest, kasutades miRNeasy Mini komplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt tootja juhistele, sealhulgas elueerimisetapi inkubatsiooniajale.RNA kontsentratsioon määrati spektrofotomeetriga NanoDrop 2000.RNA mikrokiipide kvaliteeti hinnati bioanalüsaatoriga Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holland).
DMEM koos 10% eksosoomivaese FBS-iga valmistati ultratsentrifuugimisega 100 000 g juures 16 tundi temperatuuril 4 °C ja filtriti läbi 0,22 µm filtri (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2 rakke, 5 × 105, kultiveeriti DMEM-is, mis sisaldas 10% eksosoomivaene FBS-i ja 1% antibiootikume, temperatuuril 37 °C ja 5% CO2.Pärast 24-tunnist inkubeerimist lisati rakkudele tüve RH või ME49 tahhüsoidid (MOI = 10) ja mittetungivad parasiidid eemaldati tunni jooksul ja täideti uuesti DMEM-iga.BV2 rakkude eksosoomid eraldati modifitseeritud diferentsiaaltsentrifuugimisega, mis on kõige laialdasemalt kasutatav meetod.RNA või valgu analüüsiks resuspendeerige eksosoomipellet 300 µl PBS-s.Eraldatud eksosoomide kontsentratsioon määrati BCA valguanalüüsi komplekti (Pierce, Rockford, IL, USA) ja NanoDrop 2000 spektrofotomeetri abil.
BV2 rakkude sademed või BV2-st saadud eksosoomid lüüsiti PRO-PREP™ valgu ekstraheerimislahuses (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) ja valgud laaditi Coomassie briljantsinise värviga 10% SDS polüakrüülamiidgeelidele.Lisaks kanti valgud 2 tunniks PVDF membraanidele.Western blotid valideeriti, kasutades eksosomaalse markerina Alixi antikeha (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).Sekundaarse antikehana kasutati HRP-konjugeeritud kitse hiirevastast IgG-d (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) ja LAS-1000 pluss luminestsentskujutise analüsaatorit (Fuji Photography Film, Tokyo, Jaapan)..Eksosoomide suuruse ja morfoloogia uurimiseks viidi läbi ülekandeelektronmikroskoopia.BV2 rakkudest eraldatud eksosoomid (6,40 µg/µl) valmistati süsinikga kaetud võrkudele ja värviti 1 minuti jooksul negatiivselt 2% uranüülatsetaadiga.Valmistatud proove vaadeldi kiirenduspingel 80 kV, kasutades JEOL 1200-EX II (Tokyo, Jaapan), mis oli varustatud ES1000W Erlangshen CCD kaameraga (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
BV2-st saadud eksosoomid värviti PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) abil 15 minutit toatemperatuuril.U87 rakke, 2 × 105, negatiivse kontrollina PKH26-märgistatud eksosoomidega (punased) või ilma eksosoomideta, inkubeeriti 37 °C juures 24 tundi 5% CO2 inkubaatoris.U87 raku tuumad värviti DAPI-ga (sinine), U87 rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 15 minutit temperatuuril 4 °C ja seejärel analüüsiti Leica TCS SP8 STED CW konfokaalse mikroskoobi süsteemis (Leica Microsystems, Mannheim, Saksamaa).jälgitav.
cDNA sünteesiti siRNA-st, kasutades Mir-X siRNA esimese ahela sünteesi ja SYBR qRT-PCR komplekti (Takara Bio Inc., Shiga, Jaapan).Reaalajas kvantitatiivne PCR viidi läbi, kasutades iQ5 reaalajas PCR tuvastamise süsteemi (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), kasutades SYBR Premixiga segatud praimereid ja malle.DNA-d amplifitseeriti 40 denatureerimistsükli jooksul 95 °C juures 15 sekundit ja anniilimist 60 °C juures 60 sekundit.Iga PCR reaktsiooni andmeid analüüsiti iQ™5 optilise süsteemi tarkvara (Bio-Rad) andmeanalüüsi mooduli abil.Suhtelised muutused geeniekspressioonis valitud sihtgeenide ja β-aktiini/siRNA (ja U6) vahel arvutati standardkõvera meetodil.Kasutatud praimerite järjestused on näidatud tabelis 1.
3 x 104 U87 glioomirakku külvati 96-süvendilistesse plaatidesse ja segati 12., 18. ja 36. tunni järel toksoplasmaga nakatunud eksosoomidega, mis pärinesid BV2-st (50 μg/ml) või BV2-st tuletatud mittepulss-eksosoomidega (50 μg/ml). .Rakkude proliferatsiooni kiirus määrati rakkude loenduskomplekti 8 (Dojindo, Kumamoto, Jaapan) abil (täiendavad joonised S1-S3) 46 .
5-nädalased emased BALB/c nude hiired osteti ettevõttest Orient Bio (Seongnam-si, Lõuna-Korea) ja neid hoiti eraldi steriilsetes puurides toatemperatuuril (22 ± 2 ° C) ja niiskusel (45 ± 15 ° C).%) toatemperatuuril (22±2°C) ja niiskusel (45±15%).12-tunnine valgustsükkel ja 12-tunnine pimedustsükkel viidi läbi SPF-i all (Souli riikliku ülikooli meditsiinikooli loomakeskus).Hiired jagati juhuslikult kolme rühma, millest igaühes oli 5 hiirt, ja kõikidele rühmadele süstiti subkutaanselt 400 ml PBS-i, mis sisaldas 1 x 107 U87 glioomirakku ja kasvufaktoriga vähendatud BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Kuus päeva pärast kasvaja süstimist süstiti kasvajakohta 200 mg BV2 rakkudest pärinevaid eksosoome (koos toksoplasma infektsiooniga / ilma).Kakskümmend kaks päeva pärast kasvajaga nakatumist mõõdeti iga rühma hiirte kasvaja suurust nihikuga kolm korda nädalas ja kasvaja maht arvutati valemiga: 0, 5 × (laius) × 2 × pikkus.
MikroRNA ekspressioonianalüüs miRCURYTM LNA miRNA massiivi abil, 7. põlvkond omab mmu ja rno massiive (EXIQON, Vedbaek, Taani), mis hõlmab 1119 hästi iseloomustatud hiirt 3100 inimese, hiire ja roti miRNA püüdmissondi hulgas.Selle protseduuri käigus eemaldati 5'-fosfaadist 250–1000 ng kogu RNA-d, töödeldes vasika soole leeliselise fosfataasiga, millele järgnes märgistamine Hy3 rohelise fluorestsentsvärviga.Seejärel hübridiseeriti märgistatud proovid, laadides mikrokiibi slaidid, kasutades hübridisatsioonikambri komplekti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja hübridisatsioonislaidikomplekti (Agilent Technologies).Hübridiseerimine viidi läbi 16 tundi temperatuuril 56 ° C, seejärel pesti mikrokiibid vastavalt tootja soovitustele.Seejärel skaneeriti töödeldud mikrokiibi slaidid, kasutades Agilent G2565CA mikrokiibi skannerisüsteemi (Agilent Technologies).Skannitud kujutised imporditi, kasutades tarkvara Agilent Feature Extraction versiooni 10.7.3.1 (Agilent Technologies) ja iga kujutise fluorestsentsi intensiivsus kvantifitseeriti, kasutades modifitseeritud Exiqoni protokolli vastavat GAL-faili.Käesoleva uuringu mikrokiibi andmed on salvestatud GEO andmebaasi registreerimisnumbri GPL32397 all.
Küpsete eksosomaalsete miRNA-de ekspressiooniprofiile toksoplasmaga nakatunud RH või ME49 tüvede mikrogliiades analüüsiti erinevate võrgutööriistade abil.Kasvaja arenguga seotud miRNA-d tuvastati kasutades miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) ja filtreeriti välja normaliseeritud signaali intensiivsusega (log2) üle 8,0.MiRNA-de hulgas leiti, et T. gondii'ga nakatunud RH või ME49 tüvede poolt muudetud miRNA-de filtrianalüüsi tulemusel on erinevalt ekspresseeritud miRNA-d rohkem kui 1,5 korda muutunud.
Rakud külvati kuue süvendiga plaatidele (3 x 105 rakku süvendi kohta) opti-MEM-is (Gibco, Carlsbad, CA, USA), kasutades Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transfekteeritud rakke kultiveeriti 6 tundi ja seejärel vahetati sööde värske täissöötme vastu.Rakud koguti 24 tundi pärast transfektsiooni.
Statistiline analüüs viidi läbi peamiselt Studenti t-testi abil Exceli tarkvaraga (Microsoft, Washington, DC, USA).Katseloomade analüüsiks viidi läbi kahesuunaline ANOVA, kasutades tarkvara Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-väärtusi < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks. P-väärtusi < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P väärtused <0,05 loeti statistiliselt oluliseks. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P väärtused <0,05 loeti statistiliselt oluliseks.
Kõik selles uuringus kasutatud katseprotokollid kiitis heaks Souli riikliku ülikooli meditsiinikooli institutsionaalse ülevaatenõukogu (IRB number SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Hinnanguline ülemaailmne vähktõve esinemissagedus ja suremus 2018. aastal: GLOBOCANi allikad ja meetodid.Tõlgendamine.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Ülevaade ajukasvajate riskiteguritest ja nende terapeutilistest sekkumistest. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Ülevaade ajukasvajate riskiteguritest ja nende terapeutilistest sekkumistest.Rashid, S., Rehman, K. ja Akash, MS Ülevaade ajukasvajate riskifaktoritest ja olulisematest terapeutilistest sekkumistest. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Sügav arusaam ajukasvaja riskiteguritest ja terapeutilistest sekkumistest.Rashid, S., Rehman, K. ja Akash, MS Ülevaade ajukasvajate riskifaktoritest ja olulisematest terapeutilistest sekkumistest.Biomeditsiiniteadus.apteeker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterite ja viiruste koostoimed inimese suuõõne ja naiste suguelundite vähi korral: epidemioloogiliste ja laboratoorsete tõendite kokkuvõte. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterite ja viiruste koostoimed inimese suuõõne ja naiste suguelundite vähi korral: epidemioloogiliste ja laboratoorsete tõendite kokkuvõte.Kato I., Zhang J. ja Sun J. Bakterite ja viiruste koostoimed inimese seedetrakti ja naiste suguelundite vähi korral: epidemioloogiliste ja laboratoorsete andmete kokkuvõte. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterite ja viiruste koostoime inimese suuõõne seedimisel ja naiste reproduktiivtraktis: populaarhaiguste teaduse ja laboratoorsete tõendite kokkuvõte.Kato I., Zhang J. ja Sun J. Bakterite ja viiruste koostoimed inimese seedetrakti vähi ja naiste suguelundite vähi korral: epidemioloogiliste ja laboratoorsete andmete kokkuvõte.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Infektsioonist vähini: kuidas DNA kasvajaviirused muudavad peremeesraku tsentraalset süsiniku ja lipiidide metabolismi. Magon, KL & Parish, JL Infektsioonist vähini: kuidas DNA kasvajaviirused muudavad peremeesraku tsentraalset süsiniku ja lipiidide metabolismi.Mahon, KL ja Parish, JL Tulenakkus vähile: kuidas DNA-põhised kasvajaviirused muudavad peremeesraku tsentraalset süsiniku ja lipiidide metabolismi. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂 Magon, KL & Parish, JL Infektsioonist vähini: kuidas DNA kasvajaviirused muudavad peremeesraku tsentraalset süsiniku ja lipiidide metabolismi.Mahon, KL ja Parish, JL Põleb vähktõve nakatumine: kuidas DNA kasvajaviirused muudavad keskmist süsiniku ja lipiidide metabolismi peremeesrakkudes.Avatud bioloogia.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM jt.Skistosoomide katehhool-östrogeenid ja maksaleestikud ning helmintidega seotud vähk.ees.seest kuum.5, 444 (2014).