Täname, et külastasite veebilehte Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Kopsu tsüstilise fibroosi raviks kasutatavad geenivektorid peavad olema suunatud juhtivatele hingamisteedele, kuna perifeerse kopsu transduktsioonil puudub ravitoime.Viiruse transduktsiooni efektiivsus on otseselt seotud kandja viibimisajaga.Kuid manustamisvedelikud, nagu geenikandjad, difundeeruvad sissehingamise ajal loomulikult alveoolidesse ja mis tahes kujuga terapeutilised osakesed eemaldatakse mukotsiliaarse transpordiga kiiresti.Geenikandjate hingamisteedes viibimise aja pikendamine on oluline, kuid raskesti saavutatav.Kandjaga konjugeeritud magnetosakesed, mida saab suunata hingamisteede pinnale, võivad parandada piirkondlikku sihtimist.In vivo pildistamise probleemide tõttu on selliste väikeste magnetosakeste käitumine hingamisteede pinnal rakendatava magnetvälja juuresolekul halvasti mõistetav.Selle uuringu eesmärk oli kasutada sünkrotronkujutist, et visualiseerida in vivo magnetosakeste liikumist tuimastatud rottide hingetorus, et uurida üksikute ja hulgiosakeste dünaamikat ja käitumismustreid in vivo.Seejärel hindasime ka seda, kas lentiviiruse magnetosakeste kohaletoimetamine magnetvälja juuresolekul suurendaks transduktsiooni efektiivsust roti hingetorus.Sünkrotronröntgenpildistamine näitab magnetosakeste käitumist statsionaarsetes ja liikuvates magnetväljades in vitro ja in vivo.Osakesi ei saa magnetite abil kergesti vedada mööda elusate hingamisteede pinda, kuid transpordi käigus koonduvad ladestused vaatevälja, kus magnetväli on tugevaim.Transduktsiooni efektiivsus suurenes ka kuus korda, kui lentiviiruse magnetosakesed tarniti magnetvälja juuresolekul.Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et lentiviiruse magnetosakesed ja magnetväljad võivad olla väärtuslikud lähenemisviisid geenivektori sihtimise ja transduktsiooni taseme parandamiseks juhtivates hingamisteedes in vivo.
Tsüstiline fibroos (CF) on põhjustatud variatsioonidest ühes geenis, mida nimetatakse CF transmembraanse juhtivuse regulaatoriks (CFTR).CFTR-valk on ioonkanal, mis esineb paljudes epiteelirakkudes kogu kehas, sealhulgas hingamisteedes, mis on tsüstilise fibroosi patogeneesi peamine koht.CFTR-i defektid põhjustavad ebanormaalset veetransporti, hingamisteede pinna dehüdratsiooni ja hingamisteede pinnavedeliku kihi (ASL) sügavuse vähenemist.Samuti kahjustab see mukotsiliaarse transpordi (MCT) süsteemi võimet puhastada hingamisteed sissehingatavatest osakestest ja patogeenidest.Meie eesmärk on välja töötada lentiviiruse (LV) geeniteraapia, et edastada CFTR geeni õige koopia ja parandada ASL-i, MCT-d ja kopsude tervist, ning jätkata uute tehnoloogiate väljatöötamist, mis suudavad neid parameetreid in vivo mõõta1.
LV-vektorid on tsüstilise fibroosi geeniteraapia üks juhtivaid kandidaate, peamiselt seetõttu, et nad suudavad terapeutilise geeni püsivalt integreerida hingamisteede basaalrakkudesse (hingamisteede tüvirakud).See on oluline, sest nad suudavad taastada normaalse hüdratatsiooni ja lima kliirensi, diferentseerudes tsüstilise fibroosiga seotud funktsionaalseteks geenidega korrigeeritud hingamisteede pinnarakkudeks, mille tulemuseks on eluaegne kasu.LV-vektorid peavad olema suunatud juhtivate hingamisteede vastu, sest sealt saab alguse kopsude kaasatus CF-sse.Vektori toimetamine sügavamale kopsu võib põhjustada alveolaarset transduktsiooni, kuid sellel ei ole tsüstilise fibroosi korral ravitoimet.Kuid vedelikud, nagu geenikandjad, migreeruvad pärast sünnitust sissehingamisel loomulikult alveoolidesse3, 4 ja MCT-de abil väljutatakse terapeutilised osakesed kiiresti suuõõnde.LV transduktsiooni tõhusus on otseselt seotud ajaga, mille jooksul vektor jääb sihtrakkude lähedale, et võimaldada rakkude omastamist – „viibimise aeg” 5, mida saab hõlpsasti lühendada nii tüüpilise piirkondliku õhuvoolu kui ka lima ja MCT osakeste koordineeritud omastamise tõttu.Tsüstilise fibroosi korral on võime pikendada LV viibimisaega hingamisteedes, et saavutada selles piirkonnas transduktsiooni kõrge tase, kuid see on seni olnud keeruline.
Selle takistuse ületamiseks teeme ettepaneku, et LV magnetosakesed (MP-d) saaksid aidata kahel üksteist täiendaval viisil.Esiteks saab neid juhtida magnetiga hingamisteede pinnale, et parandada sihtimist ja aidata geenikandja osakestel olla hingamisteede õiges piirkonnas;ja ASL) liiguvad rakukihti 6. MP-sid kasutatakse laialdaselt sihitud ravimite kohaletoimetamise kandjatena, kui nad seonduvad antikehade, keemiaravi ravimite või muude väikeste molekulidega, mis kinnituvad rakumembraanidele või seonduvad nende vastavate rakupinna retseptoritega ja akumuleeruvad kasvaja kohtadesse. staatilise elektri olemasolu.Vähiravi magnetväljad 7. Teised hüpertermilised meetodid on suunatud kasvajarakkude hävitamisele MP-de kuumutamise teel, kui need puutuvad kokku võnkuvate magnetväljadega.Magnettransfektsiooni põhimõtet, mille puhul kasutatakse magnetvälja transfektsiooniagensina DNA rakkudesse ülekandmise kiirendamiseks, kasutatakse tavaliselt in vitro, kasutades mitmesuguseid mitteviiruslikke ja viiruslikke geenivektoreid raskesti ülekantavate rakuliinide jaoks. ..Tehti kindlaks LV-magnetotransfektsiooni efektiivsus LV MP kohaletoimetamisega in vitro inimese bronhide epiteeli rakuliini staatilise magnetvälja juuresolekul, suurendades transduktsiooni efektiivsust 186 korda võrreldes ainult LV-vektoriga.LV MT-d on rakendatud ka tsüstilise fibroosi in vitro mudelile, kus magnetiline transfektsioon suurendas LV transduktsiooni õhu-vedeliku liidese kultuurides tsüstilise fibroosi röga juuresolekul 20 korda10.In vivo organite magnetotransfektsioon on aga saanud suhteliselt vähe tähelepanu ja seda on hinnatud vaid mõnes loomkatses 11, 12, 13, 14, 15, eriti kopsudes 16, 17.Magnettransfektsiooni võimalused tsüstilise fibroosi kopsuteraapias on aga selged.Tan et al.(2020) väitsid, et "magnetiliste nanoosakeste tõhusa kopsude manustamise valideerimisuuring sillutab teed tulevastele CFTR-i sissehingamise strateegiatele, et parandada tsüstilise fibroosiga patsientide kliinilisi tulemusi"6.
Väikeste magnetosakeste käitumist hingamisteede pinnal rakendatud magnetvälja juures on raske visualiseerida ja uurida ning seetõttu on need halvasti mõistetavad.Teistes uuringutes oleme välja töötanud sünkrotronil põhineva faasikontraströntgenpildi (PB-PCXI) meetodi mitteinvasiivseks pildistamiseks ja ASL18 sügavuse ja MCT19 käitumise väikeste in vivo muutuste kvantifitseerimiseks20, et mõõta otseselt gaasikanali pinna hüdratsiooni. ja seda kasutatakse varajase ravi efektiivsuse indikaatorina.Lisaks kasutab meie MCT hindamismeetod PB-PCXI21-ga nähtavate MCT-markeritena 10–35 µm läbimõõduga osakesi, mis koosnevad alumiiniumoksiidist või kõrge murdumisnäitajaga klaasist.Mõlemad meetodid sobivad mitmesuguste osakeste tüüpide, sealhulgas MP-de pildistamiseks.
Kõrge ruumilise ja ajalise eraldusvõime tõttu sobivad meie PB-PCXI-põhised ASL- ja MCT-testid hästi üksikute ja hulgiosakeste dünaamika ja käitumismustrite uurimiseks in vivo, et aidata meil mõista ja optimeerida MP geeni kohaletoimetamise meetodeid.Siin kasutatav lähenemisviis põhineb meie uuringutel, milles kasutati SPring-8 BL20B2 kiirtejoont, milles visualiseerisime vedeliku liikumist pärast näivvektori annuse manustamist hiirte nina- ja kopsu hingamisteedesse, et aidata selgitada meie täheldatud heterogeenseid geeniekspressiooni mustreid. meie geenis.loomkatsed kandeannusega 3,4 .
Selle uuringu eesmärk oli kasutada PB-PCXI sünkrotronit, et visualiseerida MP-de seeria in vivo liikumisi elusate rottide hingetorus.Need PB-PCXI pildiuuringud olid mõeldud MP-seeriate, magnetvälja tugevuse ja asukoha testimiseks, et teha kindlaks nende mõju MP liikumisele.Eeldasime, et väline magnetväli aitaks tarnitud MF-il sihtpiirkonda jääda või liikuda.Need uuringud võimaldasid meil ka määrata magneti konfiguratsioonid, mis maksimeerivad pärast sadestumist hingetorusse jäänud osakeste hulka.Teises uuringute seerias püüdsime kasutada seda optimaalset konfiguratsiooni, et näidata transduktsioonimustrit, mis tuleneb LV-MP-de in vivo kohaletoimetamisest roti hingamisteedesse, eeldades, et LV-MP-de kohaletoimetamine hingamisteede sihtimise kontekstis suurenenud LV ülekande efektiivsus..
Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Adelaide'i ülikooli (M-2019-060 ja M-2020-022) ja SPring-8 Synchrotron Animal Animal Ethics Committee poolt heaks kiidetud protokollidele.Katsed viidi läbi vastavalt ARRIVE soovitustele.
Kõik röntgenpildid tehti Jaapanis SPring-8 sünkrotronis BL20XU valgusvihus, kasutades eelnevalt kirjeldatud seadistust 21, 22.Lühidalt öeldes asus katsekast sünkrotroni salvestusrõngast 245 m kaugusel.Osakeste pildistamise uuringutes kasutatakse proovi ja detektori kaugust 0,6 m ja in vivo kujutise uuringutes 0,3 m, et luua faasikontrastsuse efekte.Kasutati monokromaatilist kiirt energiaga 25 keV.Pildid saadi kõrge eraldusvõimega röntgenmuunduri (SPring-8 BM3) abil, mis oli ühendatud sCMOS-detektoriga.Andur teisendab röntgenikiirguse nähtavaks valguseks, kasutades 10 µm paksust stsintillaatorit (Gd3Al2Ga3O12), mis seejärel suunatakse sCMOS-andurile, kasutades ×10 (NA 0,3) mikroskoobiobjektiivi.sCMOS-detektor oli Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jaapan), mille massiivi suurus oli 2048 × 2048 pikslit ja töötlemata piksli suurus 6,5 × 6,5 µm.See säte annab efektiivse isotroopse piksli suuruse 0,51 µm ja vaatevälja umbes 1,1 mm × 1,1 mm.Kokkupuute kestus 100 ms valiti selleks, et maksimeerida magnetosakeste signaali-müra suhet hingamisteedes ja väljaspool, minimeerides samal ajal hingamisest põhjustatud liikumisartefakte.In vivo uuringute jaoks asetati röntgeni teele kiire röntgeni katik, et piirata kiirgusdoosi, blokeerides röntgenikiire särituste vahel.
LV-meediumit ei kasutatud üheski SPring-8 PB-PCXI kujutise uuringus, kuna BL20XU pildistamiskambril ei ole 2. bioohutuse taseme sertifikaati.Selle asemel valisime kahelt kaubanduslikult müüjalt välja rea ​​hästi iseloomustatud MP-sid, mis hõlmavad erinevaid suurusi, materjale, raua kontsentratsioone ja rakendusi – kõigepealt selleks, et mõista, kuidas magnetväljad mõjutavad MP-de liikumist klaaskapillaarides, ja seejärel elavad hingamisteed.pinnale.MP suurus varieerub vahemikus 0,25 kuni 18 µm ja on valmistatud erinevatest materjalidest (vt tabel 1), kuid iga proovi koostis, sealhulgas MP magnetosakeste suurus, pole teada.Meie ulatuslike MCT-uuringute 19, 20, 21, 23, 24 põhjal eeldame, et kuni 5 µm MP-sid on näha hingetoru hingamisteede pinnal, näiteks lahutades järjestikused kaadrid, et näha MP liikumise paremat nähtavust.Üks MP 0,25 µm on väiksem kui pildindusseadme eraldusvõime, kuid PB-PCXI peaks pärast sadestamist tuvastama nende mahulise kontrasti ja vedeliku liikumise pinnale, millele need sadestatakse.
Näidised tabelis iga MP kohta.1 valmistati 20 μl klaaskapillaarides (Drummond Microcaps, PA, USA), mille siseläbimõõt oli 0,63 mm.Korpuskulaarsed osakesed on saadaval vees, CombiMag osakesed aga tootja patenteeritud vedelikus.Iga tuub täidetakse pooleldi vedelikuga (umbes 11 µl) ja asetatakse proovihoidjale (vt joonis 1).Klaaskapillaarid asetati vastavalt pildistamiskambri lavale horisontaalselt ja asetati vedeliku servadesse.Haruldasest muldmetallist, neodüümist, rauast ja boorist (NdFeB) valmistatud 19 mm läbimõõduga (28 mm pikkune) nikkelkoorega magnet (N35, kat. nr LM1652, Jaycar Electronics, Austraalia), mille remanents on 1,17 T, kinnitati saavutamiseks eraldi ülekandetabel. Muutke renderdamise ajal oma asukohta kaugjuhtimisega.Röntgenpildistamine algab siis, kui magnet asetseb umbes 30 mm proovi kohal ja kujutised saadakse 4 kaadrit sekundis.Pildistamise ajal viidi magnet klaasist kapillaartoru lähedale (umbes 1 mm kaugusele) ja seejärel liigutati mööda toru, et hinnata väljatugevuse ja asukoha mõju.
In vitro kujutise seadistus, mis sisaldab MP proove klaaskapillaarides xy proovi translatsiooni etapis.Röntgenkiire teekond on tähistatud punase punktiirjoonega.
Kui MP-de in vitro nähtavus oli kindlaks tehtud, testiti nende alamhulka in vivo metsiktüüpi emastel Wistari albiinorottidel (~ 12 nädalat vanad, ~ 200 g).Medetomidiin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Jaapan), midasolaam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Jaapan) ja butorfanool 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rotid anesteseeriti Pharma (Jaapan) seguga intraperitoneaalse süstimise teel.Pärast anesteesiat valmistati need ette pildistamiseks, eemaldades hingetoru ümbert karva, sisestades endotrahheaalse toru (ET; 16 Ga intravenoosne kanüül, Terumo BCT) ja immobiliseerides need lamavasse asendisse termokotti sisaldavale eritellimusel valmistatud pildiplaadile. kehatemperatuuri hoidmiseks.22. Seejärel kinnitati pildistamisplaat pildistamiskastis oleva proovi staadiumi külge väikese nurga all, et joondada hingetoru röntgenpildil horisontaalselt, nagu on näidatud joonisel 2a.
(a) In vivo pildistamise seadistus pildiseadmes SPring-8, punase punktiirjoonega tähistatud röntgenkiire tee.( b, c ) Hingetoru magneti lokaliseerimine viidi läbi eemalt, kasutades kahte ortogonaalselt paigaldatud IP-kaamerat.Ekraanil oleva pildi vasakus servas on näha pead hoidev traatsilmus ja ET toru sisse paigaldatud manustamiskanüül.
Kaugjuhitav süstlapumbasüsteem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), milles kasutati 100 µl klaassüstalt, ühendati PE10 toruga (0,61 mm OD, 0,28 mm ID), kasutades 30 Ga nõela.Märkige toru tagamaks, et ots on hingetorus endotrahheaalse toru sisestamisel õiges asendis.Mikropumba abil eemaldati süstla kolb ja toru ots sukeldati kohaletoimetatava MP proovi sisse.Laaditud manustamistoru sisestati seejärel endotrahheaalsesse torusse, asetades selle otsa meie eeldatava rakendatud magnetvälja tugevaimasse ossa.Kujutiste saamist kontrolliti meie Arduino-põhise ajastuskastiga ühendatud hingamisdetektori abil ning kõik signaalid (nt temperatuur, hingamine, katiku avamine/sulgemine ja pildi saamine) salvestati Powerlabi ja LabCharti (AD Instruments, Sydney, Austraalia) abil. 22 Pildistamise ajal Kui korpus polnud saadaval, paigutati kaks IP-kaamerat (Panasonic BB-SC382) üksteise suhtes ligikaudu 90° nurga all ja neid kasutati pildistamise ajal magneti asendi kontrollimiseks hingetoru suhtes (joonis 2b, c).Liikumisartefaktide minimeerimiseks saadi hingamisvoolu lõpptasandil üks pilt hingetõmbe kohta.
Magnet on kinnitatud teise astme külge, mis võib asuda eemalt pildistamiskeha välisküljel.Katsetati magneti erinevaid asendeid ja konfiguratsioone, sealhulgas: paigutatud ligikaudu 30° nurga all hingetoru kohal (konfiguratsioonid on näidatud joonistel 2a ja 3a);üks magnet on looma kohal ja teine ​​allpool, poolused on seatud külgetõmbamiseks (joonis 3b)., üks magnet looma kohal ja teine ​​allpool, poolused on seatud tõrjumiseks (joonis 3c) ja üks magnet hingetoru kohal ja sellega risti (joonis 3d).Pärast looma ja magneti seadistamist ning testitava MP laadimist süstlapumpa manustage kujutiste saamisel 50 µl annus kiirusega 4 µl/s.Seejärel liigutatakse magnetit piki hingetoru või üle selle edasi-tagasi, jätkates samal ajal kujutiste omandamist.
Magneti konfiguratsioon in vivo pildistamiseks (a) üks magnet hingetoru kohal ligikaudu 30° nurga all, (b) kaks külgetõmbamiseks konfigureeritud magnetit, (c) kaks magnetit, mis on konfigureeritud tõrjumiseks, (d) üks magnet ülalpool ja risti. hingetoru.Vaatleja vaatas suust alla kopsudesse läbi hingetoru ja röntgenikiir läbis roti vasakut külge ja väljus paremalt poolt.Magnet liigutatakse kas piki hingamisteede pikkust või hingetoru kohal vasakule ja paremale röntgenkiire suunas.
Samuti püüdsime määrata hingamisteedes olevate osakeste nähtavust ja käitumist hingamise ja südame löögisageduse segunemise puudumisel.Seetõttu surmati loomad pildistamisperioodi lõpus pentobarbitaali üledoosi tõttu humaanselt (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Mõned loomad jäeti pildistamisplatvormile ning pärast hingamise ja südametegevuse lakkamist korrati pildistamisprotsessi, lisades täiendava annuse MP-d, kui MP-d ei olnud hingamisteede pinnal näha.
Saadud kujutisi korrigeeriti tasase ja tumeda välja jaoks ning koondati seejärel filmiks (20 kaadrit sekundis; 15–25 × normaalne kiirus sõltuvalt hingamissagedusest), kasutades kohandatud skripti, mis on kirjutatud MATLABis (R2020a, The Mathworks).
Kõik LV-geenivektori kohaletoimetamise uuringud viidi läbi Adelaide'i ülikooli laboratoorses loomauuringute keskuses ja nende eesmärk oli kasutada katse SPring-8 tulemusi, et hinnata, kas LV-MP kohaletoimetamine magnetvälja juuresolekul võib suurendada geeniülekannet in vivo .MF ja magnetvälja mõju hindamiseks raviti kahte loomarühma: ühele rühmale süstiti LV MF koos magneti paigutusega ja teisele rühmale süstiti kontrollrühmale LV MF ilma magnetita.
LV geenivektorid on genereeritud eelnevalt kirjeldatud meetodite 25, 26 abil.LacZ vektor ekspresseerib tuumas lokaliseeritud beeta-galaktosidaasi geeni, mida juhib MPSV konstitutiivne promootor (LV-LacZ), mis toodab transdutseeritud rakkudes sinise reaktsiooniprodukti, mis on nähtav kopsukoe esikülgedel ja lõikudel.Tiitrimine viidi läbi rakukultuurides, loendades käsitsi LacZ-positiivsete rakkude arvu, kasutades hemotsütomeetrit, et arvutada tiiter TU/ml.Kandjaid külmsäilitatakse temperatuuril -80 °C, sulatatakse enne kasutamist ja seotakse CombiMagiga, segades 1:1 ja inkubeerides jääl vähemalt 30 minutit enne tarnimist.
Normaalsed Sprague Dawley rotid (n = 3 rühma kohta, umbes 2-3 tuimestatud ip 0,4 mg/kg medetomidiini (Domitor, Ilium, Austraalia) ja 60 mg/kg ketamiini (Ilium, Austraalia) seguga 1 kuu vanuselt) ip ) süstimine ja mittekirurgiline suukaudne kanüül 16 Ga intravenoosse kanüüliga.Tagamaks, et hingetoru hingamisteede kude saab LV transduktsiooni, konditsioneeriti seda meie eelnevalt kirjeldatud mehaanilise häirimise protokolli abil, milles hingetoru hingamisteede pinda hõõruti aksiaalselt traatkorviga (N-Circle, nitinoolkivi ekstraktor ilma otsata NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 lk 28.Seejärel, umbes 10 minutit pärast häiret bioohutuskapis, manustati LV-MP hingetoru.
Selles katses kasutatud magnetväli konfigureeriti sarnaselt in vivo röntgenuuringuga, kusjuures samu magneteid hoiti hingetoru kohal destilleerimisstentklambritega (joonis 4).50 µl maht (2 x 25 µl alikvooti) LV-MP viidi hingetorusse (n = 3 looma), kasutades geeli otsaga pipetti, nagu eelnevalt kirjeldatud.Kontrollrühm (n = 3 looma) sai sama LV-MP-d ilma magnetit kasutamata.Pärast infusiooni lõpetamist eemaldatakse kanüül endotrahheaalsest torust ja loom ekstubeeritakse.Magnet jääb enne eemaldamist paigale 10 minutiks.Rottidele manustati subkutaanselt meloksikaami (1 ml/kg) (Ilium, Austraalia), millele järgnes anesteesia tühistamine atipamasoolvesinikkloriidi 1 mg/kg intraperitoneaalse süstimisega (Antisedan, Zoetis, Austraalia).Rotte hoiti soojas ja jälgiti kuni anesteesiast täieliku taastumiseni.
LV-MP väljastusseade bioloogilises turvakapis.Näete, et ET toru helehall Luer-lock hülss ulatub suust välja ning joonisel kujutatud geelpipeti ots sisestatakse ET toru kaudu soovitud sügavusele hingetorusse.
Nädal pärast LV-MP manustamisprotseduuri hukati loomad humaanselt 100% CO2 sissehingamise teel ja LacZ ekspressiooni hinnati meie standardse X-gal ravi abil.Kolm kõige sabakõhre rõngast eemaldati tagamaks, et analüüsi ei kaasatud endotrahheaaltoru paigutamisest tingitud mehaanilisi kahjustusi või vedelikupeetust.Iga hingetoru lõigati pikisuunas, et saada analüüsiks kaks poolt, ja asetati silikoonkummi sisaldavasse tassi (Sylgard, Dow Inc), kasutades Minutieni nõela (Fine Science Tools), et visualiseerida luminaalset pinda.Transdutseeritud rakkude jaotumist ja iseloomu kinnitati frontaalfotograafiaga, kasutades Nikoni mikroskoopi (SMZ1500) koos DigiLite kaamera ja TCapture tarkvaraga (Tucsen Photonics, Hiina).Pildid saadi 20-kordse suurendusega (sealhulgas hingetoru täislaiuse maksimaalne seadistus), kusjuures kogu hingetoru pikkus kuvati samm-sammult, pakkudes iga kujutise vahel piisavat kattumist, et võimaldada pilte "õmmelda".Seejärel ühendati iga hingetoru kujutised üheks komposiitpildiks, kasutades Composite Image Editor versiooni 2.0.3 (Microsoft Research), kasutades tasapinnalise liikumise algoritmi. LacZ ekspressiooni pindala iga looma hingetoru komposiitkujutistes kvantifitseeriti, kasutades automatiseeritud MATLAB-skripti (R2020a, MathWorks), nagu eelnevalt kirjeldatud28, kasutades sätteid 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 ja Value < 0,7. LacZ ekspressiooni pindala iga looma hingetoru komposiitkujutistes kvantifitseeriti automatiseeritud MATLAB-skripti (R2020a, MathWorks) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud28, kasutades sätteid 0,35 < Hue <0,58, Saturation> 0,15 ja Value <0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественисна количественелпопопоп изированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, нашна>0,58, насых ,7. LacZ ekspressiooni pindala iga looma hingetoru liitpiltidel kvantifitseeriti automatiseeritud MATLAB-skripti (R2020a, MathWorks) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud28, kasutades sätteid 0,350,15 ja väärtus<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复AC囡进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置.如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气箐 的 嚏 复表达 量化, 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。. 。………………………………………………………………………………………………………… Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определественно определнияполи с сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15,7ениезначе, 7 . LacZ ekspressiooni alad iga looma hingetoru liitpiltidel kvantifitseeriti automatiseeritud MATLAB-skripti (R2020a, MathWorks) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud, kasutades seadeid 0,35 < toon < 0,58, küllastus> 0,15 ja väärtus <0,7 .Jälgides koe kontuure GIMP v2.10.24-s, loodi iga liitkujutise jaoks käsitsi mask, et tuvastada koepiirkond ja vältida mis tahes väärtuvastusi väljaspool hingetoru kude.Iga looma kõigi komposiitpiltide värvitud alad liideti, et saada selle looma värvitud ala kogusumma.Seejärel jagati värvitud ala maski kogupindalaga, et saada normaliseeritud ala.
Iga hingetoru sisestati parafiini ja lõigati 5 µm paksuseks.Sektsioone värviti neutraalse kiire punasega 5 minutit ja pildid saadi Nikon Eclipse E400 mikroskoobi, DS-Fi3 kaamera ja NIS-elementide hõivamise tarkvara (versioon 5.20.00) abil.
Kõik statistilised analüüsid viidi läbi programmis GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistiliseks olulisuseks määrati p ≤ 0,05.Normaalsust testiti Shapiro-Wilki testiga ja erinevusi LacZ värvimises hinnati paaritu t-testi abil.
Tabelis 1 kirjeldatud kuut MP-d uuriti PCXI-ga ja nähtavust kirjeldatakse tabelis 2. PCXI ei näinud kahte polüstüreeni MP-d (vastavalt MP1 ja MP2; 18 µm ja 0,25 µm), kuid ülejäänud proovid oli tuvastatavad. (näited on toodud joonisel 5).MP3 ja MP4 on nõrgalt nähtavad (vastavalt 10-15% Fe3O4; 0,25 µm ja 0,9 µm).Kuigi MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) sisaldas väikseimaid testitud osakesi, oli see kõige tugevam.CombiMag MP6 toodet on raske eristada.Kõigil juhtudel paranes meie võime MF-e tuvastada, liigutades magnetit kapillaariga paralleelselt edasi-tagasi.Kui magnetid liikusid kapillaarist eemale, tõmmati osakesed välja pikkade ahelatena, kuid magnetite lähenedes ja magnetvälja tugevuse suurenedes osakeste ahelad lühenesid, kuna osakesed migreerusid kapillaari ülemise pinna poole (vt lisavideot S1 : MP4), suurendades osakeste tihedust pinnal.Ja vastupidi, kui magnet eemaldatakse kapillaarist, väheneb väljatugevus ja MP-d ümber paigutatakse pikkadeks ahelateks, mis ulatuvad kapillaari ülemisest pinnast (vt lisavideot S2: MP4).Pärast magneti liikumise lõpetamist jätkavad osakesed mõnda aega pärast tasakaaluasendi saavutamist.Kui MP liigub kapillaari ülemise pinna poole ja sellest eemale, kipuvad magnetosakesed tõmbama prahti läbi vedeliku.
MP nähtavus PCXI all on näidiste lõikes märkimisväärselt erinev.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6.Kõik siin näidatud pildid tehti magnetiga, mis paiknes umbes 10 mm otse kapillaari kohal.Näivad suured ringid on kapillaaridesse kinni jäänud õhumullid, mis näitavad selgelt faasikontrastpildi mustvalgeid servaomadusi.Punane kast tähistab kontrasti suurendavat suurendust.Pange tähele, et magnetahelate läbimõõdud kõigil joonistel ei ole mõõtkavas ja on ligikaudu 100 korda suuremad kui näidatud.
Kui magnet liigub piki kapillaari ülaosa vasakule ja paremale, muutub MP stringi nurk, et joondada magnetiga (vt joonis 6), piiritledes seega magnetvälja jooned.MP3-5 puhul lohisevad osakesed pärast seda, kui akord on jõudnud lävinurgani, mööda kapillaari ülemist pinda.Selle tulemuseks on sageli MP-de koondumine suurematesse rühmadesse selle lähedal, kus magnetväli on tugevaim (vt lisavideot S3: MP5).See on eriti ilmne ka kapillaari otsa lähedal pildistamisel, mis põhjustab MP agregatsiooni ja kontsentreerumist vedeliku-õhu liidesel.MP6-s olevad osakesed, mida oli raskem eristada kui MP3-5-s, ei lohisenud, kui magnet liikus mööda kapillaari, kuid MP-stringid dissotsieerusid, jättes osakesed vaatevälja (vt lisavideot S4: MP6).Mõnel juhul, kui rakendatud magnetvälja vähendati magneti liigutamisega pildistamiskohast kaugele, laskusid kõik järelejäänud MP-d raskusjõu toimel aeglaselt toru alumisele pinnale, jäädes stringi (vt lisavideot S5: MP3) .
MP stringi nurk muutub, kui magnet liigub kapillaari kohal paremale.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6.Punane kast tähistab kontrasti suurendavat suurendust.Pange tähele, et lisavideod on informatiivsel eesmärgil, kuna need paljastavad olulist osakeste struktuuri ja dünaamilist teavet, mida ei saa nendel staatilistel piltidel visualiseerida.
Meie testid on näidanud, et magneti aeglaselt edasi-tagasi liigutamine mööda hingetoru hõlbustab MF-i visualiseerimist keerulise liikumise kontekstis in vivo.In vivo teste ei tehtud, kuna polüstüreenhelmed (MP1 ja MP2) ei olnud kapillaaris nähtavad.Kõiki ülejäänud nelja MF-i testiti in vivo nii, et magneti pikitelg oli hingetoru kohal vertikaali suhtes umbes 30° nurga all (vt joonised 2b ja 3a), kuna see andis tulemuseks pikemad MF-ahelad ja oli tõhusam. kui magnet..konfiguratsioon lõpetati.MP3, MP4 ja MP6 ei ole leitud ühegi eluslooma hingetorust.Rottide hingamisteid visualiseerides pärast loomade humaanset tapmist, jäid osakesed nähtamatuks isegi siis, kui süstalpumba abil lisati täiendavat mahtu.MP5-l oli kõrgeim raudoksiidi sisaldus ja see oli ainus nähtav osake, seega kasutati seda MP käitumise hindamiseks ja iseloomustamiseks in vivo.
Magneti paigutamine hingetoru kohale MF-i sisestamise ajal põhjustas paljude, kuid mitte kõigi MF-ide koondumise vaatevälja.Osakeste hingetoru sisenemist on kõige parem jälgida humaanselt eutaniseeritud loomadel.Joonis 7 ja täiendav video S6: MP5 näitab kiiret magnetilist püüdmist ja osakeste joondamist ventraalse hingetoru pinnal, mis näitab, et MP-sid saab suunata hingetoru soovitud piirkondadesse.Pärast MF-i manustamist hingetoru kaugemal otsimisel leiti mõned MF-id karinale lähemal, mis näitab, et kõigi MF-ide kogumiseks ja hoidmiseks pole piisavat magnetvälja tugevust, kuna need toimetati vedeliku manustamise ajal läbi maksimaalse magnetvälja tugevuse piirkonna.protsessi.Sünnitusjärgsed MP kontsentratsioonid olid aga pildipiirkonna ümber kõrgemad, mis viitab sellele, et paljud MP-d jäid hingamisteede piirkondadesse, kus rakendatud magnetvälja tugevus oli kõrgeim.
Pildid (a) enne ja (b) pärast MP5 kohaletoimetamist hiljuti eutaniseeritud roti hingetorusse magnetiga, mis on asetatud vahetult pildistamisala kohale.Kujutatud ala asub kahe kõhrelise rõnga vahel.Enne MP kohaletoimetamist on hingamisteedes veidi vedelikku.Punane kast tähistab kontrasti suurendavat suurendust.Need pildid on võetud S6: MP5 lisavideos olevast videost.
Magneti liigutamine piki hingetoru in vivo põhjustas MP-ahela nurga muutuse hingamisteede pinnal, mis on sarnane kapillaarides täheldatule (vt joonis 8 ja täiendav video S7: MP5).Kuid meie uuringus ei saanud MP-sid mööda elavate hingamisteede pinda lohistada, nagu kapillaarid seda teha saaksid.Mõnel juhul pikeneb MP kett, kui magnet liigub vasakule ja paremale.Huvitaval kombel avastasime ka, et osakeste ahel muudab vedeliku pinnakihi sügavust, kui magnetit liigutatakse piki hingetoru, ja laieneb, kui magnetit liigutatakse otse pea kohal ja osakeste kett pööratakse vertikaalasendisse (vt. Täiendav video S7).: MP5 kell 0:09, all paremal).Iseloomulik liikumismuster muutus, kui magnetit liigutati külgsuunas üle hingetoru ülaosa (st loomast vasakule või paremale, mitte piki hingetoru).Osakesed olid liikumise ajal endiselt selgelt nähtavad, kuid kui magnet hingetorust eemaldati, muutusid osakeste stringide otsad nähtavaks (vt lisavideot S8: MP5, alates 0:08).See on kooskõlas magnetvälja käitumisega klaaskapillaaris rakendatud magnetvälja mõjul.
Näidispildid, mis näitavad MP5-d elava tuimestatud roti hingetorus.(a) Magnetit kasutatakse piltide saamiseks hingetoru kohal ja vasakul, seejärel (b) pärast magneti paremale liigutamist.Punane kast tähistab kontrasti suurendavat suurendust.Need pildid pärinevad videost, mis on esitatud S7 täiendavas videos: MP5.
Kui kaks poolust häälestati hingetoru kohal ja all põhja-lõuna suunal (st tõmbasid ligi; joonis 3b), paistsid MP akordid pikemad ja paiknesid pigem hingetoru külgseinal kui hingetoru seljapinnal. hingetoru (vt lisa).Video S9:MP5).Siiski ei tuvastatud osakeste kõrgeid kontsentratsioone ühes kohas (st hingetoru seljapinnal) pärast vedeliku manustamist kahe magnetiga seadmega, mis tavaliselt toimub ühe magnetseadmega.Siis, kui üks magnet oli konfigureeritud vastandpooluste tõrjumiseks (joonis 3c), ei suurenenud vaateväljas nähtavate osakeste arv pärast kohaletoimetamist.Mõlema magneti konfiguratsiooni seadistamine on keeruline kõrge magnetvälja tugevuse tõttu, mis tõmbab vastavalt magneteid ligi või surub.Seejärel muudeti seadistus ühele magnetile, mis on paralleelne hingamisteedega, kuid läbib hingamisteid 90-kraadise nurga all, nii et jõujooned ületasid hingetoru seina ortogonaalselt (joonis 3d). külgmine sein.jälgida.Kuid selles konfiguratsioonis ei olnud tuvastatavat MF-i akumulatsiooni liikumist ega magneti liikumist.Kõigi nende tulemuste põhjal valiti geenikandjate in vivo uuringute jaoks ühe magnetiga ja 30-kraadise orientatsiooniga konfiguratsioon (joonis 3a).
Kui loomast tehti kohe pärast humaanset ohverdamist mitu korda kujutist, tähendas segava koe liikumise puudumine seda, et selges kõhredevahelises väljas võis märgata peenemaid ja lühemaid osakeste jooni, mis "kõikusid" vastavalt magneti translatsioonilisele liikumisele.selgelt näha MP6 osakeste olemasolu ja liikumist.
LV-LacZ tiiter oli 1,8 x 108 IU/ml ja pärast 1:1 segamist CombiMag MP-ga (MP6) süstiti loomadele 50 µl hingetoru doosi 9 x 107 IU/ml LV kandjat (st 4,5). x 106 TU/rott).).).Nendes uuringutes fikseerisime magneti sünnituse ajal liigutamise asemel magneti ühte asendisse, et teha kindlaks, kas LV transduktsiooni saab (a) parandada võrreldes vektori edastamisega magnetvälja puudumisel ja (b) kas hingamisteed saaksid olla keskendunud.Rakud transdutseeritakse ülemiste hingamisteede magnetilistes sihtpiirkondades.
Magnetite olemasolu ja CombiMagi kasutamine koos LV-vektoritega ei paistnud loomade tervist kahjustavat, nagu ka meie standardne LV-vektori kohaletoimetamise protokoll.Mehaaniliselt häiritud hingetoru piirkonna esiosa kujutised (täiendav joonis 1) näitasid, et LV-MP-ga ravitud rühmal oli magneti juuresolekul oluliselt kõrgem transduktsiooni tase (joonis 9a).Kontrollrühmas esines ainult väike kogus sinist LacZ värvimist (joonis 9b).X-Gal värvitud normaliseeritud piirkondade kvantifitseerimine näitas, et LV-MP manustamine magnetvälja juuresolekul andis tulemuseks ligikaudu 6-kordse paranemise (joonis 9c).
Näide liitpiltidest, mis näitavad hingetoru transduktsiooni LV-MP-ga (a) magnetvälja juuresolekul ja (b) magneti puudumisel.(c) Statistiliselt oluline paranemine LacZ transduktsiooni normaliseeritud piirkonnas hingetorus magneti kasutamisega (*p = 0,029, t-test, n = 3 rühma kohta, keskmine ± keskmise standardviga).
Neutraalsed kiirelt punaseks värvitud lõigud (näide on näidatud täiendaval joonisel 2) näitasid, et LacZ-värvitud rakud olid samas proovis ja samas kohas, nagu varem teatati.
Hingamisteede geeniteraapia peamiseks väljakutseks jääb kandeosakeste täpne lokaliseerimine huvipakkuvates piirkondades ja kõrge transduktsiooni efektiivsuse saavutamine liikuvas kopsus õhuvoolu ja aktiivse lima kliirensi juuresolekul.Tsüstilise fibroosi hingamisteede haiguste raviks mõeldud LV-kandjate puhul on kandjaosakeste viibimisaja pikendamine juhtivates hingamisteedes olnud seni saavutamatu eesmärk.Nagu Castellani jt märkisid, on magnetväljade kasutamisel transduktsiooni suurendamiseks eelised teiste geenide kohaletoimetamise meetodite, näiteks elektroporatsiooni ees, kuna see võib kombineerida lihtsust, ökonoomsust, lokaliseeritud kohaletoimetamist, suurenenud efektiivsust ja lühemat inkubatsiooniaega.ja võimalik, et vehiikli väiksem annus10.Magnetosakeste in vivo ladestumist ja käitumist hingamisteedes väliste magnetjõudude mõjul pole aga kunagi kirjeldatud ning tegelikult ei ole selle meetodi võimet tõsta geeniekspressiooni taset tervetes elusate hingamisteedes in vivo tõestatud.
Meie in vitro katsed PCXI sünkrotroniga näitasid, et kõik meie testitud osakesed, välja arvatud MP polüstüreen, olid meie kasutatud pildistamise seadistuses nähtavad.Magnetvälja olemasolul moodustavad magnetväljad stringid, mille pikkus on seotud osakeste tüübi ja magnetvälja tugevusega (st magneti läheduse ja liikumisega).Nagu on näidatud joonisel 10, moodustuvad meie vaadeldavad stringid, kui iga üksik osake magnetiseerub ja kutsub esile oma kohaliku magnetvälja.Need eraldi väljad põhjustavad teiste sarnaste osakeste kogunemist ja ühendumist rühmastringide liikumistega, mis on tingitud kohalikest jõududest, mis tulenevad teiste osakeste tõmbe- ja tõrjumisjõududest.
Diagramm, mis näitab (a, b) vedelikuga täidetud kapillaarides moodustuvate osakeste ahelaid ja (c, d) õhuga täidetud hingetoru.Pange tähele, et kapillaarid ja hingetoru ei ole mõõtkavasse tõmmatud.Paneel (a) sisaldab ka MF-i kirjeldust, mis sisaldab ahelatesse paigutatud Fe3O4 osakesi.
Kui magnet liikus üle kapillaari, saavutas osakeste stringi nurk Fe3O4 sisaldava MP3-5 jaoks kriitilise läve, misjärel osakeste jada ei püsinud enam algses asendis, vaid liikus mööda pinda uude asendisse.magnet.See efekt ilmneb tõenäoliselt seetõttu, et klaaskapillaari pind on piisavalt sile, et see liikumine toimuks.Huvitav on see, et MP6 (CombiMag) nii ei käitunud, võib-olla seetõttu, et osakesed olid väiksemad, neil oli erinev kate või pinnalaeng või patenteeritud kandevedelik mõjutas nende liikumisvõimet.CombiMagi osakeste kujutise kontrastsus on samuti nõrgem, mis viitab sellele, et vedelikul ja osakestel võib olla sama tihedus ja seetõttu ei saa nad kergesti üksteise poole liikuda.Osakesed võivad kinni jääda ka siis, kui magnet liigub liiga kiiresti, mis näitab, et magnetvälja tugevus ei suuda alati ületada vedelikus olevate osakeste vahelist hõõrdumist, mis viitab sellele, et magnetvälja tugevus ning magneti ja sihtala vaheline kaugus ei tohiks olla üllatus.oluline.Need tulemused näitavad ka seda, et kuigi magnetid suudavad kinni püüda paljusid sihtpiirkonda läbivaid mikroosakesi, on ebatõenäoline, et CombiMagi osakeste liigutamiseks piki hingetoru pinda saab magnetitele loota.Seega jõudsime järeldusele, et in vivo LV MF-uuringud peaksid kasutama staatilisi magnetvälju, et füüsiliselt sihtida hingamisteede puu konkreetseid piirkondi.
Kui osakesed on kehasse toimetatud, on neid keha keerulise liikuva koe kontekstis raske tuvastada, kuid nende tuvastamisvõimet on parandatud magneti liigutamisega horisontaalselt üle hingetoru, et MP-stringe “vigutada”.Kuigi reaalajas pildistamine on võimalik, on osakeste liikumist lihtsam tuvastada pärast looma humaanset tapmist.MP kontsentratsioonid olid tavaliselt selles kohas kõrgeimad, kui magnet asetati pildistamisala kohale, kuigi tavaliselt leiti mõningaid osakesi hingetorust allpool.Erinevalt in vitro uuringutest ei saa osakesi magneti liikumisega hingetorust alla tõmmata.See leid on kooskõlas sellega, kuidas hingetoru pinda kattev lima töötleb tavaliselt sissehingatud osakesi, püüdes need lima ja seejärel puhastades need läbi limaskesta ja tsiliaarse kliirensi.
Hüpoteesisime, et hingetoru kohal ja all olevate magnetite kasutamine külgetõmbamiseks (joonis 3b) võib anda ühtlasema magnetvälja, mitte ühes punktis väga kontsentreeritud magnetvälja, mille tulemuseks võib olla osakeste ühtlasem jaotus..Kuid meie esialgne uuring ei leidnud selle hüpoteesi toetuseks selgeid tõendeid.Samamoodi ei põhjustanud magnetipaari tõukejõu seadmine (joonis 3c) suuremat osakeste settimist pildialal.Need kaks leidu näitavad, et kahe magnetiga seadistus ei paranda oluliselt MP-osutamise kohalikku juhtimist ja et sellest tulenevaid tugevaid magnetjõude on raske häälestada, muutes selle lähenemisviisi vähem praktiliseks.Samamoodi ei suurendanud magneti suunamine hingetoru kohal ja üle (joonis 3d) pildistatud alale jäänud osakeste arvu.Mõned neist alternatiivsetest konfiguratsioonidest ei pruugi olla edukad, kuna need põhjustavad magnetvälja tugevuse vähenemist sadestuspiirkonnas.Seega peetakse ühe magnetiga konfiguratsiooni 30 kraadi juures (joonis 3a) kõige lihtsamaks ja tõhusaimaks in vivo testimismeetodiks.
LV-MP uuring näitas, et kui LV-vektorid kombineeriti CombiMagiga ja manustati pärast füüsilist häirimist magnetvälja juuresolekul, suurenes transduktsiooni tase hingetorus kontrollrühmaga võrreldes oluliselt.Sünkrotronkuvamise uuringute ja LacZ tulemuste põhjal näis, et magnetväli suudab hoida LV hingetorus ja vähendada vektoriosakeste arvu, mis tungisid kohe sügavale kopsu.Sellised sihtimise täiustused võivad viia suurema efektiivsuseni, vähendades samal ajal tarnitud tiitreid, mittesihitud transduktsiooni, põletikulisi ja immuunseid kõrvaltoimeid ning geeniülekandekulusid.Oluline on see, et tootja sõnul saab CombiMagi kasutada koos teiste geeniülekandemeetoditega, sealhulgas teiste viirusvektoritega (näiteks AAV) ja nukleiinhapetega.