Giardia duodenum on parasiitorganism, mis põhjustab giardiaasi – sooleinfektsiooni, mis on eriti levinud kõhulahtisuse kliiniliste tunnustega väikelastel.Oleme varem teatanud, et ekstratsellulaarne G. duodenalis käivitab rakusisese oligomerisatsioonilaadse retseptori 3 (NLRP3) siduvate nukleotiidide aktiveerimise ja reguleerib peremeesorganismi põletikulisi reaktsioone rakuvälise vesiikuli (EV) sekretsiooni kaudu.Selle protsessiga seotud patogeeniga seotud duodenokoki EV (GEV) täpsed molekulaarsed mustrid ja NLRP3 põletiku roll giardiaasi korral tuleb siiski veel välja selgitada.
GEV-s konstrueeriti rekombinantsed eukarüootsed ekspressiooniplasmiidid pcDNA3.1(+)-alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid, transfekteeriti hiire primaarsetesse peritoneaalsetesse makrofaagidesse ja tuvastati põletiku sihtmolekuli kaspaas-1 mõõtmise teel.Skriiniti p20 ekspressioonitaset..G. duodenalis alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid tuvastati algselt NLRP3 põletiku (NLRP3, pro-interleukiin-1 beeta [IL-1β], pro-kaspaas-1 ja kaspaas-1 p20), IL sekretsiooni mõõtmise teel.1β tasemed, apoptootilise laigulise valgu (ASC) oligomerisatsiooni tasemed ja NLRP3 ja ASC immunofluorestsents lokaliseerimine.Seejärel hinnati NLRP3 põletiku rolli G. duodenalis'e patogeensuses, kasutades hiirt, kellel NLRP3 aktivatsioon oli blokeeritud (NLRP3 blokeeritud hiired) ning jälgiti patoloogilisi muutusi kehakaalus, kaksteistsõrmiksoole parasiitide koormuse ja kaksteistsõrmiksoole kudedes.Lisaks uurisime, kas hiardiinid alfa-2 ja alfa-7.3 indutseerivad IL-1β sekretsiooni in vivo NLRP3 inflammasoomi kaudu ja määrasime nende molekulide rolli G. duodenalis'e patogeensuses hiirtel.
Alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid kutsuvad esile NLRP3 põletikulise aktivatsiooni in vitro.See tõi kaasa p20 kaspaas-1 aktiveerumise, NLRP3, pro-IL-1β ja pro-kaspaas-1 valkude ekspressioonitaseme tõusu, IL-1β sekretsiooni märkimisväärse suurenemise, ASA täppide moodustumise veres. tsütoplasma ja ASA oligomerisatsiooni indutseerimine.NLRP3 põletik Peenise kaotus suurendab G. duodenalis'e patogeensust hiirtel.Hiirtel, keda raviti NLRP3-blokeeritud hiirte sondiga tsüstidega, ilmnes suurenenud trofosoiitide arv ja kaksteistsõrmiksoole villi tõsine kahjustus, mida iseloomustasid kokkutõmbunud ja hargnevate nekrootiliste krüptide arv.In vivo katsed on näidanud, et giardiinid alfa-2 ja alfa-7.3 võivad indutseerida IL-1β sekretsiooni NLRP3 põletiku kaudu ning immuniseerimine giardiinide alfa-2 ja alfa-7.3-ga vähendas G. duodenalis'e patogeensust hiirtel.
Kokkuvõttes näitavad selle uuringu tulemused, et giardia alfa-2 ja alfa-7.3 põhjustavad peremeesorganismi NLRP3 põletiku ülesreguleerimist ja vähendavad G. duodenalis'e nakkavust hiirtel, mis on paljulubavad eesmärgid giardiaasi ennetamisel.
Giardia duodenum on rakuväline algloomade parasiit, mis elab peensooles ja põhjustab igal aastal 280 miljonit giardiaasi koos kõhulahtisusega, eriti arengumaade väikelastel [1].Inimesed nakatuvad joogivee või toiduga, mis on saastunud M. duodenum tsüstidega, mis seejärel sisenevad makku ja erituvad maomahlaga.Giardia kaksteistsõrmiksoole trofosoidid kinnituvad kaksteistsõrmiksoole epiteeli külge, põhjustades iiveldust, oksendamist, kõhulahtisust, kõhuvalu ja kehakaalu langust.Immuunpuudulikkuse ja tsüstilise fibroosiga inimesed on vastuvõtlikud infektsioonidele.Nakatumine võib tekkida ka oraalseksi ja anaalseksi kaudu [2].Sellised ravimid nagu metronidasool, tinidasool ja nitasoksaniid on kaksteistsõrmiksoole infektsioonide puhul eelistatud ravivõimalused [3].Need keemiaravi ravimid põhjustavad aga kahjulikke kõrvaltoimeid, nagu iiveldus, kantserogenees ja genotoksilisus [4].Seetõttu tuleb G. duodenalis'e nakkuse vältimiseks välja töötada tõhusamad strateegiad.
Inflammasoomid on tsütosoolsete valgukomplekside klass, mis on osa kaasasündinud immuunvastusest, aidates kaitsta patogeenide sissetungi eest ja vahendada põletikulisi reaktsioone [5].Nendest põletikulistest protsessidest on põhjalikult uuritud nukleotiidi siduva oligomerisatsiooni (NOD) retseptori 3 (NLRP3) nukleotiidi siduva oligomerisatsiooni (NLRP3) nukleotiidiga seonduvat põletikku, kuna seda saab tuvastada erinevate patogeeni/kahjustusega seotud molekulaarsete mustritega (PAMP/). DAMP), tunneb ära, aktiveerib kaasasündinud immuunsüsteemi.ja reguleerib soolestiku homöostaasi paljude põletikuliste haiguste korral [6, 7, 8].See koosneb mustrituvastuse retseptorist (PRR) NLRP3, adapteri apoptootilisest täpilisest valgust (ASC) ja efektorprokaspaas-1 või prokaspaas-11.NLRP3 inflammasoom toimib peremehena patogeenide sissetungi vastu, nagu on täheldatud Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] ja Leishmania uuringutes.[11], kuid on ka teatatud, et NLRP3 põletikulise põletiku aktiveerimine piirab kaitsvaid immuunvastuseid ja süvendab haiguse progresseerumist, näiteks usside puhul [12].Varasemate leidude põhjal teatasime, et ekstratsellulaarne G. duodenalis vallandab NLRP3 põletiku rakusisese aktivatsiooni ja moduleerib peremeesorganismi põletikulisi reaktsioone ekstratsellulaarsete vesiikulite (EV) sekreteerimise teel [13].NLRP3 inflammasoomi roll G. duodenalis'e infektsioonis in vivo tuleb siiski kindlaks teha.
Giardiinid kirjeldati algselt G. duodenalis'e tsütoskeleti struktuurikomponentidena ja neil on oluline roll trofosoiitide liikuvuses ja epiteelirakkude kinnitumises peensooles.Keskkonnaga paremaks kohanemiseks ja patogeensuse suurendamiseks arendasid G. duodenalis trophozoites välja ainulaadse tsütoskeleti struktuuri, mis koosnes 8 flagellast, 1 keskkehast ja 1 kõhukettast [14].Giardia duodenumi trofosoidid kasutavad oma tsütoskeletti, et tungida peensoole ülaossa, eriti kaksteistsõrmiksoole, ja kinnituda enterotsüütidele.Nad migreeruvad pidevalt ja kinnituvad rakkude metabolismi kasutades epiteelirakkudele.Seetõttu on nende tsütoskeleti ja virulentsuse vahel tihe seos.Giardia duodenumile spetsiifilised giardiinid on tsütoskeleti struktuuri komponendid [15] ja jagunevad nelja klassi: α-, β-, γ- ja δ-giardiinid.α-giardiinide perekonda kuulub 21 liiget, kellel kõigil on kaltsiumist sõltuv võime siduda fosfolipiide [16].Samuti ühendavad nad tsütoskeleti rakumembraaniga.G. duodenalis'e põhjustatud kõhulahtisusega isikutel on α-giardiinid kõrge ekspressiooniga ja infektsiooni ajal immunoreaktiivsed [17].Giardia alfa-1-l põhinevad heteroloogsed vaktsiinid kaitsesid hiirtel giardiaasi eest ja on potentsiaalsed antigeenid vaktsiini väljatöötamiseks [18].Alfa-8 giardiin, mis paikneb plasmamembraanis ja flagellas, kuid mitte kõhukettas, suurendab G. duodenalis'e trofosoiitide motoorikat ja kasvukiirust [19].Alfa-14 giardiin kinnitub lippude mikrotuubulite struktuuridele ja mõjutab G. duodenalis'e elujõulisust [20].Alfa-11 giardiini esineb ohtralt kogu elutsükli vältel ning alfa-11 giardiini üleekspressioon kahjustab G. duodenalist ennast [21].Siiski on ebaselge, kas alfa-2-giardiin ja alfa-7,3-giardiin kaitsevad G. duodenalis'e infektsiooni ja nende aluseks olevate mehhanismide eest.
Selles uuringus transfekteeriti rekombinantsed eukarüootsed ekspressiooniplasmiidid pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiin ja pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardiin hiire primaarsetesse peritoneaalsetesse makrofaagidesse, et aktiveerida peremees-NLRP3.Seejärel sõeluti põletikulisi sihtmärke.Samuti hindasime NLRP3 põletiku rolli G. duodenalis'e patogeensuses, uurisime, kas alfa-2 ja alfa-7,3 giardiinid kutsuvad esile NLRP3 põletikulise aktivatsiooni in vivo, ja tegime kindlaks, et need kaks rolli giardiinide patogeensuses G. duodenalis.Meie ühine eesmärk oli välja töötada paljutõotavad eesmärgid G. duodenalis'e nakkuse ennetamiseks.
Metsikut tüüpi (WT) C57BL/6 emased hiired vanuses 5–8 nädalat osteti Liaoning Changshengi katseloomade keskusest (Liaoning, Hiina).Hiirtel oli vaba juurdepääs veele, nad said steriliseeritud toitu ja neid hoiti 12/12-tunnises valguse/pimeduse tsüklis.Enne nakatumist said hiired antibiootikume ad libitum joogivees, millele oli lisatud ampitsilliini (1 mg/ml), vankomütsiini (1 mg/ml) ja neomütsiini (1,4 mg/ml) (kõik ostetud Shanghaist, Hiinast, tehisorganismid) [22 ].].Hiired, kes kaotasid võime süüa ja juua > 24 tunniks ja kaotasid ≥ 20% kehakaalust, hukati humaanselt emakakaela nihestuse teel.
WB G. duodenalis'e trofosoididele (American Type Culture Collection, Manassas, USA) lisati 12,5% veise loote seerumit (FBS; Every Green, Zhejiang, Hiina) ja 0,1% veise sapi (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) mikroaeroobsetes tingimustes.Konfluentsed trofosoidid koguti jääle ja passeeriti vahekorras 1:4 edasiseks paljundamiseks.
Giardia kaksteistsõrmiksoole tsüstid indutseeriti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [23], trofosoidid koguti logaritmilises faasis ja seejärel lahjendati kapseldamist indutseeriva söötmega, pH 7,1 (modifitseeritud TYI-S-33) lõppkontsentratsioonini 1 × 106 trofosoidi / ml.sapi kontsentratsioon 0,05% sööde).Trofosoite kultiveeriti anaeroobsetes tingimustes 37 °C juures kuni logaritmilise kasvufaasini.Vahetage sööde tsüste esilekutsuva söötme vastu (pH 7,8; ​​modifitseeritud TYI-S-33 sööde 1% sapikontsentratsiooniga) ja kultiveerige G. duodenalis 37°C juures 48–96 tundi, mille jooksul jälgiti mikroskoobi all tsüstide teket.Pärast seda, kui enamik trofosoiite oli indutseeritud tsüstide moodustumiseks, koguti kultuurisegu ja resuspendeeriti steriilses deioniseeritud vees, et lüüsida ülejäänud trofosoiidid.Tsüstid loendati ja säilitati 4 °C juures järgnevateks analüüsideks hiirte mao sondi kaudu.
Giardia ekstratsellulaarsed vesiikulid (GEV) rikastati, nagu eelnevalt kirjeldatud [13].Logaritmilises kasvufaasis olevad trofosoidid resuspendeeriti modifitseeritud TYI-S-33 söötmes, mis oli valmistatud eksosoomivaese FBS-iga (Biological Industries, Beit-Haemek, Iisrael), kuni lõppkontsentratsioonini 1 × 106 parasiiti/ml ja inkubeeriti 12 tundi.eraldati kultuuri supernatandist tsentrifuugimisega kiirusel 2000 g 10 minutit, 10 000 g 45 minutit ja 100 000 g 60 minutit.Sademed lahustati fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), kvantifitseeriti BCA valguanalüüsi komplektiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja säilitati temperatuuril -80 °C või kasutati otse edasisteks analüüsideks.
Hiire primaarsed kõhukelme makrofaagid valmistati nagu eelnevalt kirjeldatud [24].Lühidalt, hiirtele (vanuses 6–8 nädalat) süstiti (intraperitoneaalselt [ip]) 2,5 ml 2,98% Difco vedelat tioglükoolisöödet (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ja neile toideti 3–4 suulagi.Makrofaagide suspensioon koguti hiirte kõhuõõnde pärast eutanaasiat ja tsentrifuugiti 3 korda 1000 g juures 10 minutit.Kogutud rakud tuvastati voolutsütomeetria abil, kasutades CD11b markerit, kuni raku puhtus oli >98%, seejärel lisati 6-süvendilistele rakukultuuriplaatidele (4,5 x 106 rakku süvendi kohta) ja inkubeeriti 10% FBS-iga (Bioindustry) 37 °C juures.ja 5% CO2.
RNA ekstraheeriti 1 × 107 trofosoidist 1 ml TRIzol reagendis (Vazyme, Nanjing, Hiina), genoomne DNA ekstraheeriti kogu G. duodenalis'e RNA-st, kasutades MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Hiina) ja komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti. kasutades MonScript RTIIII Super Mixi (Monad) vastavalt tootja juhistele.
CDS-järjestuse teave sihtmärk-G. duodenalis'e geeni kohta saadi NCBI GenBank-ist.Kasutage programmi Primer 5.0, et kujundada iga sihtgeeni jaoks spetsiifilised õmblusteta kloonimispraimerid.Edasine praimer (5'-3') koosneb kolmest osast: kattuvast järjestusest lineariseeritud vektoriga pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) ja stardikoodonitest ATG ja GNN (kui esimene alus ei ole G).Seda tehakse väljenduse tõhususe parandamiseks.Lisaks vähemalt 16 bp kombineeritud aluseid (GC sisaldus 40–60%/Tm ca 55 °C).Pöördpraimer (5'-3') koosneb kahest osast, kattuvast järjestusest EcoRV-lineariseeritud vektoriga pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ja kombineeritud alusest, mille pikkus on vähemalt 16 aluspaari.(v.a kaks viimast peatust).alused) koodon, nagu AA või GA, et võimaldada rekombinantsetel plasmiididel ekspresseerida oma märgistatud valke).Praimerite järjestused on loetletud tabelis 1 ja need sünteesis Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Hiina).
Sihtmärgid amplifitseeriti, kasutades Pfu DNA polümeraasi (Tiangen, Peking, Hiina) või Ex-taqi (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Hiina), kasutades matriitsina valmistatud G. duodenalis cDNA-d.Eukarüootse ekspressioonivektori plasmiid pcDNA3.1(+) lineariseeriti restriktsiooniensüümiga EcoRV ja defosforüüliti, kasutades Fast AP-d (Thermo Fisher Scientific).Lineariseeritud pcDNA3.1(+) fragmendid ja amplifitseeritud sihtgeeni fragmendid puhastati, kasutades DNA geelipuhastuskomplekti (Tiangen) ja kvantifitseeriti, kasutades Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+) fragment ja iga sihtgeeni fragment rekombineeriti, kasutades MonClone'i üksikkomplekti kloonimise segu (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Hiina) ja kinnitati DNA sekveneerimisega, kasutades Comate Bioscience Company Limited'i (Changchun, Hiina)..
Endotoksiinivabad plasmiidid pcDNA3.1(+)-alpha-2 ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 genereeriti SanPrep Endotoksiinivaba Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) abil.Kontsentratsiooni hoiti üle 500 ng/µl tagamaks, et elueerimispuhvris olev EDTA ei segaks transfektsioonianalüüsi.Hiire primaarseid peritoneaalseid makrofaage kultiveeriti 6-süvendilistel plaatidel täieliku RPMI 1640 söötmega (Biological Industries) 12 tundi, seejärel pesti rakke 3 korda soojas PBS-is, et eemaldada penitsilliini ja streptomütsiini, ning seejärel söötmes, millele oli lisatud täielikku söödet.Endotoksiinivabad plasmiidid pcDNA3.1(+)-alpha-2 ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) lahjendati 125 μl Opti-MEM redutseeritud seerumi söötmes (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Seejärel lahjendati 5 µl Lipofectamine 2000 transfektsioonireaktiivi (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 µl madala seerumi Opti-MEM söötmes.Valmistage ette liposoomi-DNA kompleksid, segades lahjendatud endotoksiinivaba plasmiidi Lipofectamine 2000-ga ja lastes segul 5 minutit toatemperatuuril seista.Viige kompleksid igas süvendis eraldi rakkudesse ja segage aeglaselt.4 tunni pärast asendati rakukultuuri sööde 2 ml täieliku RPMI 1640 söötmega ja kultiveerimist jätkati 24 tundi.Rakkudele lisati värske rakukultuuri sööde ja inkubeeriti erinevatel ajahetkedel olenevalt analüüsi ülesehitusest.
Supernatantidest ja rakulüsaatidest pärit valguproovid valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil [25].Pro-IL-1β, pro-kaspaas-1, kaspaas-1 p20, NLRP3, β-aktiini ja His-märgise membraaniülekande parameetrid olid 200 mA/90 min.Interleukiin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), kaspaas-1 (p20) (Adipogen, Šveits) ja NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Šveits) ja 1:5000 jaoks, mis on suunatud His märgisele (Amylet Scientific) Wuhan, Hiina) ja β-aktiini (Proteintech, Wuhan, Hiina).
Ristsidumine disuktsiinimiidi suberaadiga (DSS) viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [26].Rakke pesti 3 korda külma PBS-ga ja lüüsiti täielikult 27 gauge nõelaga 50 µl ASC reaktsioonipuhvris (pH 8,0), mis sisaldas 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES ja 125 mM NaHC03.Segu tsentrifuugiti 5000 g juures 3 minutit ja pellet õmmeldi 10 µl DSS-iga (25 mM DMSO-s) ja 40 µl ASC reaktsioonipuhvriga 30 minutit temperatuuril 37 °C.Pärast 10-minutilist tsentrifuugimist 5000 g juures lahustati pellet lahuses, mis sisaldas 40 µl ASC reaktsioonipuhvrit ja 10 µl 6x valgu laadimispuhvrit (TransGen, Peking, Hiina) ning seejärel jahutati lahust toatemperatuuril 15 minutit. min., Seejärel keeda 10 minutit.Seejärel viidi valguproovidega läbi Western blot, kasutades primaarseid ASC-vastaseid antikehi (Wanleibio, Shenyang, Hiina) lahjendussuhtega 1:500.
Pärast eelnevalt kirjeldatud protseduuri [13] koguti rakukultuuri supernatandid ja määrati põletikueelse tsütokiini IL-1β sekretsioon, kasutades hiire IL-1 beeta ELISA komplekti (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Teisendage OD450nm väärtused valgu kontsentratsioonideks, kasutades IL-1β standardkõverat.
Katteklaasidele kaetud rakke pesti õrnalt 3 korda soojas PBS-s, fikseeriti koerakkude fiksaatoris (Biosharp, Peking, Hiina) 10 minutit toatemperatuuril (RT) 0,1% Triton X-Permeabilize lahuses 100 °C juures (lahjendatud PBS-is; Biosharp). ) 20 minutit toatemperatuuril ja blokeerige 5% veise seerumi albumiiniga (PBS-is) 2 tundi toatemperatuuril.Seejärel inkubeeriti rakke üleöö temperatuuril 4 °C ASC (lahjendus 1:100) või NLRP3 (lahjendus 1:100) ja Cy3-märgistatud kitse küülikuvastase IgG(H+L) (1:400; EarthOx) vastaste primaarsete antikehadega. , San Francisco, CA, USA) või FITC-konjugeeritud kitse hiirevastane IgG (1:400; Earthox) üleöö temperatuuril 37 °C pimedas 1 tund.Tuumad värviti Hoechst 33258-ga (10 μg/ml; UE, Suzhou, Hiina) 5 minutit ja vaadeldi fluorestsentsmikroskoobi all (Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan).
Hiired jagati nelja rühma (n = 7 igas rühmas): (i) PBS-ga töödeldud negatiivne kontrollrühm (ainult PBS; sondiga 100 µl/hiire PBS-i, millele järgnes 3 tundi hiljem igapäevane intraperitoneaalne süstimine 100 µl/hiire PBS-i kohta)., pidevalt 7 päeva jooksul);(ii) negatiivne kontrollrühm, keda raviti MCC950 inhibiitoriga [27] (100 µl hiire kohta PBS-soondiga, 3 tundi hiljem, 10 mg/kg kehamassi kohta [BW] MCC950 [PBS-is] manustati intraperitoneaalselt iga päev, kestus 7 päeva);(iii) G. duodenalis'e tsüstinfektsiooni rühm (1,5 x 106 tsüsti hiire kohta sondiga, 3 tundi hiljem, 100 μl hiire kohta PBS-i intraperitoneaalselt manustatuna iga päev 7 päeva jooksul);(iv) G. duodenalis'e tsüsti kombineeritud nakkusrühma MCC950 inhibiitori ravirühm (1,5 × 106 tsüsti hiire kohta sondiga, 10 mg/kg kehamassi kohta MCC950 intraperitoneaalselt iga päev 7 päeva 3 tunni jooksul).Iga hiire kehakaalu jälgiti iga päev ja kõik hiired surmati 7. päeval.Koristatud kaksteistsõrmiksool (pikkusega 3 cm) lõigati väikesteks tükkideks 1 ml PBS-is, tsüstid hävitati üleöö PBS-is temperatuuril 4 °C ja G. duodenalis trophozoites.Hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimiseks eraldati värske kaksteistsõrmiksool (pikkusega 1 cm).
Hiired jagati kahte rühma: (i) MOCK kontrollrühm ja (ii) MCC950 inhibiitori rühm.Igas rühmas tehti viis ravi (n = 7 ravirühma kohta): (i) PBS-ravi negatiivne kontrollrühm (ainult PBS; 100 µl/hiire PBS, intramuskulaarne (IM) süstimine (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmiidne negatiivne kontrollrühm (100 ug/hiire DNA, intramuskulaarse süstiga (iii) G. duodenalis'e tsüstinfektsiooni positiivne kontrollrühm (1,5 x 106 tsüsti hiire kohta, sondiga) (iv) a); rühm, keda töödeldi plasmiidiga pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 µg hiire DNA kohta, intramuskulaarse süstimise teel) ja (v) rühm, keda töödeldi plasmiidiga pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg hiire kohta) DNA, pärast 12-tunnist passaaži, said MCC950 inhibiitori rühma hiired iga päev intraperitoneaalselt MCC950 (10 mg/kg kehamassi kohta) 7 päeva jooksul, samas kui MOCK rühma hiired said samaväärse koguse PBS-ravi. Vereproovid võeti koguti silmamunade hiirtelt ja jäeti ööseks temperatuurile 4 °C. Seerumiproovid eraldati IL-1β tasemete ja ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) abil.
Kolmkümmend viis hiirt jagati viide rühma (n = 7 rühma kohta).Rühm 1 oli negatiivne kontrollrühm, keda raviti PBS-iga: hiired said 100 μl PBS-i intramuskulaarselt ja 3 päeva hiljem sondiga.2. rühm on positiivne kontrollrühm, kes oli nakatunud G. duodenalis'e tsüstidega: hiirtele süstiti 100 µl PBS-i ja 3 päeva pärast süstiti intragastraalselt 1,5 x 106 tsüsti hiire kohta.Kolmas rühm – plasmiidne immuniseerimine pcDNA3.1(+)-ga kombinatsioonis kaksteistsõrmiksoole tsüstinfektsiooni kontrollrühmaga: hiired said suukaudselt 100 μg plasmiidset DNA-d pcDNA3.1(+)(im), 1,5 × 106 tsüsti hiire kohta 3 mitu korda päevadel.Rühmad 4 ja 5 olid rekombinantne pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiini plasmiid või pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardiini plasmiid kombinatsioonis G. duodenalis'e tsüstinfektsiooniga.Katserühm: hiired said 100 µg pcDNA3.1(+)-giardiini plasmiidne DNA (im), seejärel 3 päeva hiljem süstiti sondi kaudu 1,5 × 106 tsüsti hiire kohta.Iga hiire kehamassi jälgiti pärast G. duodenalis'e tsüsti sisestamist läbi toru.Parasiitkoormuse mõõtmiseks ja HE värvimise analüüsiks koguti värske kaksteistsõrmiksool.
Histopatoloogilisi muutusi analüüsiti varem avaldatud protseduuri kohaselt [30].Värske kaksteistsõrmiksool fikseeriti koerakkude fiksaatoriga, sisestati parafiini, lõigati 4 μm osadeks, värviti H&E-ga ja analüüsiti valgusmikroskoobi all.Patoloog, kes ei teadnud ravist, hindas esinduslikke patoloogilisi muutusi seitsme sõltumatu hiire seitsmes koeosas ja need jäädvustati 200-kordse suurendusega.Villi pikkus ja krüptide sügavus mõõdeti vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetoditele.
Tulemused in vitro ja in vivo saadi kolmes korduses.Graafikud genereeriti programmiga GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Kahe rühma vahelisi erinevusi analüüsiti t-testiga, samas kui erinevusi ≥3 rühma vahel analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades SPSS-i tarkvara (versioon 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Andmeid analüüsiti dispersiooni homogeensuse suhtes, kasutades Levene testi, millele järgnes Bonferroni post hoc test (B).Olulisust väljendatakse kui P<0,05, P<0,01 ja P<0,001 (mitteoluline [ns]) (P>0,05).
Meie eelmine GEV-i proteoomika analüüs Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedias (KEGG) näitas, et paljud sihtmärgid võivad olla seotud põletikuliste signaaliradade aktiveerimisega [13].Valisime kaks paljutõotavat sihtmärki, alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid, amplifitseerisime neid molekule ja kasutasime neid pcDNA3.1(+) eukarüootse ekspressioonivektori konstrueerimiseks.Pärast sekveneerimist transfekteeriti rekombinantsed pcDNA3.1(+)-alfa-2 ja alfa-7.3 giardiini ekspressiooniplasmiidid primaarsetesse hiire peritoneaalsetesse makrofaagidesse ja identifitseeriti põletiku kaspaas-1 p20 signatuurvalk (aktiveeritud kaspaas-1 fragment). kui selgitada välja võtmemolekulid, mis võivad põletikku vallandada.Tulemused näitasid, et alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid võivad indutseerida p20 kaspaas-1 ekspressiooni, mis on sarnane GEV-ga.Töötlemata negatiivse kontrolli (ainult PBS) ja plasmiidse kontrolli pcDNA3.1(+) puhul ei leitud mingit mõju kaspaas-1 aktivatsioonile (joonis 1).
P20 kaspaas-1 aktivatsiooni mõõtmine pcDNA3.1(+)-alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinide abil.Rekombinantsed eukarüootsed ekspressiooniplasmiidid pcDNA3.1(+)-alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid (iga raja kohal) transfekteeriti hiire primaarsetesse peritoneaalsetesse makrofaagidesse ja kultuuri supernatandid koguti 24 tundi hiljem.Signatuurkaspaas-1 p20 põletikulise valgu ekspressioonitaseme mõõtmiseks kasutati Western blot analüüsi.Negatiivse kontrollina kasutati ainult PBS-ravi rühma (rada C) ja pcDNA3.1(+) monoteraapia rühma (pcDNA3.1 rada) ning positiivse kontrollina GEV-ravi rühma.Rekombinantse valgu ekspressiooni kinnitati histidiini märgise tuvastamisega igas valgus ja eeldatavad valguribad olid alfa-2 giardiin (38,2 kDa) ja alfa-7,3 giardiin (37,2 kDa).GEV, Giardia kaksteistsõrmiksoole ekstratsellulaarsed vesiikulid, pcDNA3.1(+), EcoRV-lineariseeritud vektor, SUP, supernatant
Et teha kindlaks, kas alfa-2 giardiin ja alfa-7.3 giardiin indutseerivad p20 kaspaas-1 ekspressiooni ja mängivad rolli peremeesorganismi NLRP3 põletikulise vastuse aktiveerimisel, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiin ja pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardiin transfekteeriti rekombinantse plasmiidse DNA-ga hiire primaarsetesse peritoneaalsetesse makrofaagidesse ning määrati peamiste põletikuliste valkude NLRP3 ekspressiooni, lokaliseerimise ja oligomerisatsiooni tasemed.Selles katses kasutati positiivse kontrollrühmana GEV-d ja negatiivseks rühmaks oli ravita rühm (ainult PBS) või pcDNA3.1(+) transfektsiooniga ravirühm.Tulemused näitasid, et nagu GEV rühmas, põhjustas giardiin pcDNA3.1(+)-alpha-2 ja giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 rekombinantne plasmiidne DNA NLRP3, pro-IL-1β ja prokaspaas-1 ja kaspaas-1 aktiveerimine (joonis 2a).Lisaks kutsusid mõlemad giardiinid esile olulise IL-1β sekretsiooni (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardiin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardiin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (joonis 2b).Enamik ASC valke olid monomeersed ravita rühmas või pcDNA3.1(+) plasmiidiga transfekteeritud ravirühmas, erinevalt pcDNA3.1(+)-alfa-2 või pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardiin.ASC oligomerisatsioon toimus GEV positiivse kontrollrühma või rühma rekombinantses plasmiidses DNA-s, mis näitas oligomeerset vormi (joonis 2c).Need esialgsed andmed viitavad sellele, et alfa-2 giardiin ja alfa-7, 3 giardiin võivad indutseerida NLRP3 põletiku aktivatsiooni.Hilisemad immunofluorestsentsuuringud ASC ja NLRP3 lokaliseerimise kohta näitasid, et negatiivses kontrollrühmas oli ASC valk hajutatud kogu tsütoplasmas ja ilmnes punktsignaalina pcDNA3.1(+)-alfa-2 stimuleerimisel giardiini või pcDNA3-ga.1(+)-alfa-7,3 giardiini rühm või GEV positiivne kontrollrühm (joonis 2d).Negatiivse kontrolli ja plasmiidiga töödeldud pcDNA 3.1 rühmas NLRP3 valgu signaali ei tuvastatud, samas kui fluorestseeruv signaalipunkt oli vastuseks pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiinile või pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 tuvastati..giardiini leidub tsütoplasmas või HEV stimuleerimisel (joonis 2e).Need andmed näitavad lisaks, et G. duodenalis giardiin alfa-2 ja giardiin alfa-7.3 aktiveerivad hiire primaarsetes peritoneaalsetes makrofaagides NLRP3 põletikulist protsessi.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiin ja pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardiin aktiveerivad hiire kõhukelme makrofaagides NLRP3 põletiku.Transfekteerige rekombinantsed eukarüootsed ekspressiooniplasmiidid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin primaarsetesse hiire peritoneaalsetesse makrofaagidesse ja rakkudesse või koguge supernatant 24 tunni jooksul ekspressiooni analüüsimiseks ja oligomerisatsiooniks. , sekretsioon.ja peamiste põletikuliste valkude lokaliseerimine.Negatiivse kontrollina kasutati ainult PBS-i (C) rühma ja pcDNA3.1(+) üksikut ravirühma ning positiivse rühmana GEV-ravi rühma.a Peamised põletikulised valgud NLRP3, sealhulgas NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspaas-1 ja p20 kaspaas-1, tuvastati Western blot analüüsiga.b IL-1β sekretsiooni tasemed supernatantides määrati ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) abil.Kontroll- ja katserühmade erinevusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades SPSS tarkvara versiooni 22.0.Tärnid näitavad olulisi erinevusi rühmade vahel **P<0,01 ja ***P<0,001.c ASC oligomerisatsioonitasemed pelletites määrati DSS-i ristsidumise analüüsiga, samas kui laadimiskontrollina kasutati ASC tasemeid rakulüsaatides.d ISC lokaliseerimise visualiseerimine immunofluorestsentsi abil.e NLRP3 lokaliseerimise visualiseerimiseks kasutati immunofluorestsentsi.ASC, apoptootilise täpitaoline valk;IL, interleukiin;NLRP3, nukleotiidi siduv oligomerisatsioonilaadne retseptor 3;ns, mitteoluline (P > 0,05)
Nii G. duodenalis kui ka selle eritavad GEV-d aktiveerivad NLRP3 põletikulist protsessi ja reguleerivad peremeesorganismi põletikulisi reaktsioone in vitro.Seega jääb NLRP3 inflammasoomi roll G. duodenalis'e patogeensuses ebaselgeks.Selle probleemi uurimiseks kavandasime katse G. duodenalis'e tsüstiga nakatunud hiirte ja G. duodenalis'e tsüstiga nakatunud hiirte ja MCC950 inhibiitorraviga ning võrdlesime NLRP3 põletikulist ekspressiooni, kui nad olid nakatunud G. duodenalis'e tsüstiga.Katse üksikasjalik skeem on näidatud joonisel 3a.Muutusi hiirte kehakaalus erinevates ravirühmades jälgiti 7 päeva pärast tsüstidega nakatumist ja tulemused on näidatud joonisel 3b.Võrreldes puhta PBS-iga ravitud rühmaga näitasid tulemused, et (i) G. duodenalis'e tsüstiga nakatunud hiirte kehakaal vähenes 3. päeval 7. päeval pärast nakatumist;(ii) ravi MCC950 inhibiitoriga ei avaldanud olulist mõju hiirte kehakaalule..Võrreldes üksikinfektsiooni rühmaga vähenes MCC950-ga ravitud kaksteistsõrmiksoole infektsiooni rühma BW erineval määral (1. päev: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. päev: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 3. päev: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, 5. päev; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; 6. päev: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175; 7. päev: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202.Need andmed näitavad, et NLRP3 põletik kaitseb hiiri olulise kaalukaotuse eest kaksteistsõrmiksoole infektsiooni varases staadiumis (2–4 päeva).Seejärel püüdsime tuvastada kaksteistsõrmiksoole loputusvedelikus G. duodenalis'e trofosoiite ja tulemused on näidatud joonisel 3c.Võrreldes G. duodenalis'e tsüstinfektsiooni rühmaga, suurenes trofosoiitide arv kaksteistsõrmiksooles oluliselt pärast NLRP3 inflammasoomi blokeerimist (t(12) = 2,902, P = 0,0133).HE-ga värvitud kaksteistsõrmiksoole kuded näitasid võrreldes negatiivse kontrolliga, mida raviti ainult PBS-i ja MCC950-ga: (i) G. duodenalis'e tsüstiinfektsioon põhjustas kaksteistsõrmiksoole villi kahjustuse (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) ja krüpti atroofia (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis'e tsüstidega nakatunud ja MCC950 inhibiitoritega ravitud hiirte kaksteistsõrmiksool.kaksteistsõrmiksoole villid olid kahjustatud ja surnud (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) koos atroofia ja krüptide hargnemisega (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (joonis 3d- f) .Need tulemused viitavad sellele, et NLRP3 inflammasoom mängib rolli G. duodenalis'e patogeensuse vähendamisel.
NLRP3 põletiku roll Giardia kaksteistsõrmiksoole infektsiooni korral.Hiirtele tehti sondiga (iv) duodenokoki tsüstid ja seejärel raviti MCC950-ga või ilma (ip).Kontrollidena kasutati üksikuid ravirühmi PBS või MCC950-ga.Eksperimentaalne rühm ja raviskeem.b Hiirte kehakaalu igas erinevas ravirühmas jälgiti 7 päeva.Erinevust G. duodenalis'e nakkusrühma ja G. duodenalis + MCC950 infektsiooni ravirühma vahel analüüsiti t-testiga, kasutades SPSS tarkvara versiooni 22.0.Tärnid näitavad olulisi erinevusi *P<0,05, **P<0,01 või ***P<0,001 juures.c Parasiitide koormus määrati trofosoiitide arvu loendamisega kaksteistsõrmiksoole loputusvedelikus.Erinevust G. duodenalis'e nakkusrühma ja G. duodenalis + MCC950 infektsiooni ravirühma vahel analüüsiti t-testiga, kasutades SPSS tarkvara versiooni 22.0.Tärnid näitavad olulisi erinevusi *P <0,05 juures.d Kaksteistsõrmiksoole histopatoloogia hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimise tulemused.Punased nooled näitavad villi kahjustust, rohelised nooled krüptide kahjustusi.Skaalariba: 100 µm.e, f Kaksteistsõrmiksoole villi kõrguse ja hiire krüpti kõrguse statistiline analüüs.Tärnid näitavad olulisi erinevusi *P <0,05 ja **P <0,01 juures.Tulemused on võetud 7 sõltumatust bioloogilisest katsest.BW, kehakaal;ig, intragastriline manustamisviis;ip, intraperitoneaalne manustamisviis;ns, mitteoluline (P > 0,05);PBS, fosfaatpuhverdatud soolalahus;WT, metsik tüüp
IL-1β sekretsioon on põletiku aktivatsiooni tunnus.Et teha kindlaks, kas G. duodenalis alfa-2 giardiin ja alfa-7.3 giardiin aktiveerivad NLRP3 peremeespõletiku in vivo, kasutasime ravimata WT hiiri (võltsrühm) ja NLRP3 põletikuga blokeeritud hiiri (MCC950 inhibeeritud ravirühm).Katse üksikasjalik skeem on näidatud joonisel 4a.Eksperimentaalsed rühmad koosnesid hiirtest, keda raviti PBS-ga, G. duodenalis'e tsüsti raviti sondiga, pcDNA3.1 intramuskulaarset süstimist ja pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiini või pcDNA3.1-alfa-7.3 giardiini intramuskulaarset süstimist.7. päeval pärast rekombinantse plasmiidi intramuskulaarset manustamist koguti seerum ja määrati igas rühmas IL-1β tase.Nagu on näidatud joonisel fig 4b, MOCK rühmas: (i) võrreldes PBS rühmaga ei avaldanud pcDNA3.1 ravi olulist mõju IL-1β sekretsioonile (ANOVA, F(4,29) = 4,062, P = 0,9998), kuid IL-β sekretsioon oli oluliselt suurenenud G. duodenalis'e tsüstirühmas (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardiin ja pcDNA3.1- Alfa-7,3 giardiini intramuskulaarne süstimine suurendas oluliselt seerumi IL-1β taset (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiin kutsus esile kõrge IL-1β sekretsiooni taseme pcDNA3.1-alfa-2 giardiini intramuskulaarse süstimise rühmas (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Võrreldes iga rühmaga MCC950 ravirühmas ja MOCK rühmas: (i) IL-1β sekretsiooni tase PBS kontrollrühmas ja pcDNA3.1 kontrollrühmas vähenes pärast MCC950 inhibiitori blokeerimist teatud määral, kuid erinevus ei olnud oluline (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) pärast MCC950 blokeerimist., IL-1β sekretsioon vähenes oluliselt G. duodenalis'e tsüstiga nakatunud rühmas, pcDNA3.1-alfa-2 giardiini rühmas ja pcDNA3.1-alfa-7.3 giardiini rühmas (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardiin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiin (9, ANOVA5, 8); ) = 3,540, P = 0,0164).Need tulemused viitavad sellele, et alfa-2 giardiin ja alfa-7.3 giardiin vahendavad NLRP3 põletikulise in vivo aktiveerimist.
pcDNA3.1(+)-giardiinid aktiveerivad NLRP3 peremeespõletiku in vivo.Hiired immuniseeriti (IM) rekombinantse eukarüootse ekspressiooniplasmiidiga pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine või pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ja seejärel töödeldi neid MCC950-ga (ip; MCC950 rühm) või mitte (näiv rühm). ).Negatiivse kontrollina kasutati PBS või pcDNA3.1(+) plasmiidiga ravirühma, positiivse kontrollina G. duodenalis'e tsüstiga ravitud rühma.Eksperimentaalne rühm ja raviskeem.b Hiirte IL-1β taset seerumis mõõdeti 7. päeval ELISA testiga.MOCK rühma rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil ning erinevusi MOCK rühma ja MCC950 rühma vahel analüüsiti SPSS tarkvara versiooni 22.0 t-testi abil.Tärnid näitavad olulisi erinevusi ravirühmade vahel MOCK-rühmas, *P<0,05 ja ***P<0,001;dollari märgid ($) näitavad olulisi erinevusi iga rühma vahel MOCK rühmas ja MCC950 rühmas P <0, 05.Seitsme sõltumatu bioloogilise katse tulemused.i, intramuskulaarne süst, ns, mitteoluline (P > 0,05)
Et uurida alfa-2 ja alfa-7.3 giardiini poolt vahendatud NLRP3 peremeespõletiku aktivatsiooni mõju G. duodenalis'e nakkavusele, kasutasime WT C57BL/6 hiiri ja süstisime alfa-2 giardiini ja alfa-7.3 giardiini.plasmiid süstiti intramuskulaarselt, 3 päeva pärast läbi G. duodenalis'e tsüsti mao sondi, misjärel jälgiti hiiri 7 päeva.Katse üksikasjalik skeem on näidatud joonisel 5a.Iga hiire kehamassi mõõdeti iga päev, värske kaksteistsõrmiksoole koe proovid koguti 7. päeval pärast maosondi kaudu manustamist, mõõdeti trofosoiitide arv ja täheldati histopatoloogilisi muutusi.Nagu on näidatud joonisel fig 5b, suurenes söötmisaja pikenemisega iga rühma hiirte kehamass järk-järgult.Hiirte MT hakkas vähenema 3. päeval pärast G. duodenalis'e tsüstide maosisest manustamist ja suurenes seejärel järk-järgult.Alfa-2 giardiini ja alfa7.3 giardiini intramuskulaarse süstimisega indutseeritud NLRP3 põletiku aktiveerimine vähendas oluliselt hiirte kehakaalu langust (1. päev: pcDNA3.1-alfa-2 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 1. päev: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardiin, ANOVA, F(4,30)=1.399, P=0.9987 2. päev: pcDNA3.1-alfa-2 giardiin, ANOVA, F(4,30) = 0,3172, P = 0,9979 2. päev: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409: pcDNA3,1-alfa-2 giardiin, F,; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3. päev: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiin, ANOVA, F(4,30) = 0,8222, P = 0,0083, 4. päev: pcDNA3.1-alfa-2VA-giard , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4. päev: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, 5. päev: pcDNA3,1-alpha 2 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5. päev: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6. päev: .1 -DNA alfa-2 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. päev: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7. päev: pcDNA3.1-alfa-2 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7. päev: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parasiitide koormust hinnati kaksteistsõrmiksooles (joonis 5c).Võrreldes töötlemata positiivse kontrolliga ja rühmaga, kellele süstiti tühja pcDNA3.1 vektorit, vähenes G. duodenalis'e trofosoiitide arv oluliselt rühmades, kellele süstiti α-2 giardiini ja α-7,3 giardiini (pcDNA3.1-alfa). -2 giardiin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P < 0,0001).Lisaks kaitses giardiin alfa-7,3 hiirtel paremini kui giardiin alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE värvimise tulemused on näidatud joonisel fig.5d–f.Hiirtel, kellele süstiti alfa-2 giardiini ja alfa-7.3 giardiini, esines vähem kaksteistsõrmiksoole kudede kahjustusi, mis väljendusid villuse kahjustuses, võrreldes hiirtega, kellele süstiti G. duodenalist ja hiirtel, kellele süstiti G. duodenalist koos tühja pcDNA3 vektoriga .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardiin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 või P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 või P = 0,0055) ja vähenenud krüpti atroofia (pcDNA3.1-alfa-2 giardiin: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 või P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 ANOVAgiardiin , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 või P = 0,0191).Need tulemused viitavad sellele, et alfa-2-giardiin ja alfa-7,3-giardiin vähendavad G. duodenalis'e nakkavust, aktiveerides NLRP3-põletiku in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiinide roll G. duodenalis'e infektsioonis.Hiired immuniseeriti (IM) rekombinantsete eukarüootsete ekspressiooniplasmiididega pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine või pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ja seejärel nakatati G. duodenalis'e tsüstidega (ig).Negatiivse kontrollrühmana kasutati PBS-rühma ja pcDNA3.1(+) + kaksteistsõrmiksoole tsüsti ravirühma ning positiivse kontrollrühmana kaksteistsõrmiksoole tsüsti ravirühma.Eksperimentaalne rühm ja raviskeem.b Hiirte MT-d igas erinevas ravirühmas jälgiti 7 päeva pärast nakatamist.Tärnid näitavad olulisi erinevusi rühmade vahel G. duodenalis'e rühmas ja pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiini rühmas, *P < 0,05, **P < 0,01 ja ***P < 0,001;dollarimärk ($) näitab olulist erinevust iga G. duodenalis'e rühma ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardiini rühma vahel, $$P<0.01 ja $$$P<0.001.c Parasiitkoormus määrati, loendades trofosoiitide arvu 1 ml kaksteistsõrmiksoole loputuses (pikkusega 3 cm) ja väljendades parasiitide arvu kaksteistsõrmiksoole cm kohta.Erinevusi G. duodenalis'e nakkusrühma, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardiini rühma ja pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardiini rühma vahel analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, kasutades SPSS tarkvara versiooni 22.0.Tärnid näitavad olulisi erinevusi **P<0,01 ja ***P<0,001 juures.d Histopatoloogilised muutused kaksteistsõrmiksooles.Punased nooled näitavad villi kahjustust, rohelised nooled krüptide kahjustusi.Skaalariba: 100 µm.e, f Hiire kaksteistsõrmiksoole kõrguse (e) ja krüpti kõrguse (f) statistiline analüüs.Joonisel 1d kujutatud rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, kasutades SPSS-i tarkvara versiooni 22.0.Tärnid näitavad olulisi erinevusi *P <0,05 ja **P <0,01 juures.Seitsme sõltumatu bioloogilise katse tulemused.ns, mitteoluline (P > 0,05)
Giardia duodenum on hästi tuntud inimeste ja teiste imetajate sooleparasiit, mis põhjustab giardiaasi.2004. aastal kaasati see WHO tähelepanuta jäetud haiguste algatusse, kuna see oli 6 aasta jooksul kõrge esinemissagedusega, eriti madala sotsiaalmajandusliku staatusega kogukondades [32].Kaasasündinud immuunsüsteem mängib kriitilist rolli immuunvastuses G. duodenalis'e infektsioonile.On teatatud, et hiire makrofaagid neelavad ja tapavad G. duodenalist, vabastades rakuvälised lõksud [33].Meie varasemad uuringud on näidanud, et G. duodenalis, mitteinvasiivne ekstratsellulaarne parasiit, aktiveerib hiire makrofaagides p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 ja NLRP3 põletikuliste signaalide radasid, et reguleerida peremeesorganismi põletikulisi reaktsioone ning vabanenud GEV võib seda protsessi tõhustada.13], 24].Täpsed PAMP-id, mis on seotud NLRP3 põletikuga reguleeritud põletikuga GEV-s, ja NLRP3 põletiku roll giardiaasi korral on siiski veel selgitamata.Nende kahe küsimuse valgustamiseks viisime läbi selle uuringu.
NLRP3 inflammasoom asub immuunrakkude tsütoplasmas ja seda võivad aktiveerida erinevad osakesed, nagu kusihappekristallid, toksiinid, bakterid, viirused ja parasiidid.Bakteriuuringutes on toksiinid tuvastatud peamiste PAMP-idena, mis aktiveerivad põletikuandureid, põhjustades põletikku ja rakusurma [34].Mõned struktuurselt mitmekesised toksiinid, nagu Staphylococcus aureuse [35] ja Escherichia coli [36] hemolüsiin, enterotoksiinist (NHE) [37] pärinev hemolüsiin BL (HBL) [37], kutsuvad esile NLRP3 põletiku aktivatsiooni.Viirusuuringud on näidanud, et virulentsusvalgud, nagu SARS-COV-2 ümbrisvalk (E) [38] ja Zika viiruse NS5 valk [39], on olulised NLRP3 retseptori poolt äratuntavad PAMP-d.Parasiitide uuringutes on teatatud, et paljud parasiidid on seotud peremeesorganismi põletikulise aktivatsiooniga, näiteks Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] ja Leishmania [42].Toxoplasma gondii virulentsusega seotud tihedad graanulivalgud GRA35, GRA42 ja GRA43 on vajalikud püroptoosi esilekutsumiseks Lewise roti makrofaagides [43].Lisaks on mõned Leishmania uuringud keskendunud üksikutele NLRP3 põletikus osalevatele molekulidele, nagu parasiitmembraani lipofosfoglükaan [44] või tsingi metalloproteaas [45].Anneksiinitaoliste alfa-giardiini geenide perekonna hulgas on alfa-1 giardiin osutunud potentsiaalseks vaktsiinikandidaadiks, mis pakub kaitset G. duodenalis'e vastu hiiremudelis [18].Meie uuringus valisime välja G. duodenalis'e virulentsusfaktorid alfa-2 ja alfa-7,3 giardiinid, mis on ainulaadsed giardiale, kuid millest on suhteliselt vähem teatatud.Need kaks sihtgeeni klooniti põletiku aktivatsiooni analüüsimiseks pcDNA3.1(+) eukarüootse ekspressioonisüsteemi vektorisse.
Meie hiiremudelis toimivad lõhustatud kaspaasi fragmendid põletikulise aktivatsiooni markeritena.Stimuleerimisel interakteerub NLRP3 ASC-ga, värbab prokaspaase ja genereerib aktiivseid kaspaase, mis lõhustavad pro-IL-1β ja pro-IL-18 küpseks IL-1β ja IL-18, vastavalt -18.Põletikulised kaspaasid (kaspaasid-1, -4, -5 ja -11) on konserveerunud tsüsteiiniproteaaside perekond, mis on kriitilise tähtsusega kaasasündinud kaitseks ning osalevad põletikus ja programmeeritud rakusurmas [46].Kaspaas-1 aktiveerivad kanoonilised põletikud [47], samas kui kaspaasid-4, -5 ja -11 lõhustatakse atüüpiliste põletikuliste põletikuliste protsesside moodustumisel [48].Selles uuringus kasutasime mudelina hiire kõhukelme makrofaage ja uurisime p20 kaspaas-1 lõhustatud kaspaas-1 peremeesorganismi NLRP3 põletiku aktivatsiooni markerina G. duodenalis'e infektsiooni uuringutes.Tulemused näitasid, et paljud alfa-giardiinid vastutavad põletiku tüüpilise aktiveerimise eest, mis on kooskõlas bakterites ja viirustes osalevate peamiste virulentsusmolekulide avastamisega.Kuid meie uuring on ainult esialgne sõeluuring ja on ka teisi molekule, mis võivad aktiveerida mitteklassikalisi põletikke, kuna meie eelmine uuring leidis G. duodenalis'e infektsioonis nii klassikalisi kui ka mitteklassikalisi põletikke [13].Et edasiseks kindlaks teha, kas genereeritud p20 kaspaas-1 on seotud NLRP3 põletikuga, transfekteerisime alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid hiire peritoneaalsetesse makrofaagidesse, et määrata võtmemolekuli valgu ekspressioonitasemed ja ASC oligomerisatsioonitasemed, kinnitades, et mõlemad α-giardiinid aktiveeruvad. põletikuline NLRP3.Meie tulemused erinevad veidi Manko-Prykhoda jt tulemustest, kes teatasid, et Caco-2 rakkude stimuleerimine ainult G. muris või E. coli EPEC tüvedega võib suurendada NLRP3, ASC ja kaspaas-1 fluorestsentsi intensiivsust. kuigi mitte oluliselt, kuid kuidas G. murise ja E. coli kostimulatsioon suurendas kolme valgu taset [49].See lahknevus võib olla tingitud erinevustest Giardia liikide, rakuliinide ja primaarsete rakkude valikus.Tegime ka in vivo analüüse, kasutades MCC950 5-nädalastel emastel WT C57BL/6 hiirtel, kes on vastuvõtlikumad G. duodenalisele.MCC950 on tugev ja selektiivne väikese molekuliga NLRP3 inhibiitor, mis blokeerib kanoonilise ja mittekanoonilise NLRP3 aktivatsiooni nanomolaarsetel kontsentratsioonidel.MCC950 inhibeerib NLRP3 aktivatsiooni, kuid ei mõjuta AIM2, NLRC4 ja NLRP1 põletikuradade ega TLR signaaliradade aktiveerimist [27].MCC950 blokeerib NLRP3 aktivatsiooni, kuid ei inhibeeri NLRP3 initsiatsiooni, K+ väljavoolu, Ca2+ sissevoolu ega interaktsiooni NLRP3 ja ASC vahel;selle asemel inhibeerib see NLRP3 põletikulist aktivatsiooni, blokeerides ASC oligomerisatsiooni [27].Seetõttu kasutasime in vivo uuringus MCC950, et määrata NLRP3 põletikuline roll pärast giardiini süstimist.Aktiveeritud kaspaas-1 p10 lõikab põletikueelsed tsütokiinid pro-IL-1β ja pro-IL-18 küpseks IL-1β ja IL-18 [50].Selles uuringus kasutati seerumi IL-1β taset giardiiniga töödeldud hiirtel koos MCC950-ga või ilma selleta, et näidata, kas NLRP3 põletik oli aktiveeritud.Nagu oodatud, vähendas MCC950 ravi oluliselt seerumi IL-1β taset.Need andmed näitavad selgelt, et G. duodenalis giardiin alfa-2 ja giardiin alfa-7.3 on võimelised aktiveerima hiire NLRP3 põletikku.
Viimase kümnendi jooksul kogutud olulised andmed on näidanud, et IL-17A on G. murise vastase immuunsuse peamine regulaator, indutseerib IL-17RA signaaliülekannet, toodab antimikroobseid peptiide ja reguleerib komplemendi aktivatsiooni [51].Siiski esineb Giardia infektsiooni sagedamini noortel täiskasvanutel ja on teatatud, et Giardia infektsioon noortel hiirtel ei aktiveeri IL-17A vastust kaitsva toime avaldamiseks [52], mis sunnib teadlasi otsima muud immunomoduleerivat Giardia.helmintinfektsiooni mehhanismid.Hiljutise uuringu autorid teatasid, et G. muris võib aktiveerida NLRP3 põletikulist E. coli EPEC-i, mis soodustab antimikroobsete peptiidide tootmist ja vähendab selle kinnitusvõimet ja trofosoiitide arvu sooletraktis, vähendades seeläbi käärsoole raskust. batsillide põhjustatud haigused [49].NLRP3 inflammasoom on seotud erinevate haiguste tekkega.Uuringud on näidanud, et Pseudomonas aeruginosa käivitab makrofaagides autofagia, et vältida rakusurma, ja see protsess sõltub NLRP3 põletikulise aktivatsioonist [53].N. caninum'i puhul piirab reaktiivsete hapnikuliikide poolt vahendatud NLRP3 põletikulise aktivatsioon selle replikatsiooni peremeesorganismis, muutes selle potentsiaalseks terapeutiliseks sihtmärgiks [9].On leitud, et Paracoccidioides brasiliensis indutseerib hiire luuüdist pärinevates dendriitrakkudes NLRP3 põletiku aktivatsiooni, mille tulemuseks on põletikulise tsütokiini IL-1β vabanemine, mis mängib peremeesorganismi kaitses olulist rolli [10].Mitmed Leishmania liigid, sealhulgas L. amazonensis, L. major, L. braziliensis ja L. infantum chagasi, aktiveerivad makrofaagides NLRP3 ja ASC-sõltuva kaspaas-1, samuti Leishmania infektsiooni.Parasiitide replikatsioon paraneb hiirtel, kellel puudub NLRP3/ASC/kaspaas-1 geen [11].Zamboni et al.On teatatud, et Leishmania infektsioon kutsub makrofaagides esile NLRP3 põletikulise aktivatsiooni, mis piirab rakusisese parasiidi replikatsiooni.Seega võib Leishmania vältimisstrateegiana pärssida NLRP3 aktivatsiooni.In vivo uuringutes aitas NLRP3 põletik kaasa Leishmania eliminatsioonile, kuid ei mõjutanud kudesid [54].Vastupidiselt pärssis helmintiaasi uuringutes NLRP3 põletiku aktiveerimine peremeesorganismi kaitsvat immuunsust seedetrakti helmintiaasi vastu [12].Shigella on üks peamisi kõhulahtisust põhjustavaid baktereid kogu maailmas.Need bakterid võivad indutseerida IL-1β tootmist P2X7 retseptori poolt vahendatud K+ väljavoolu, reaktiivsete hapnikuliikide, lüsosomaalse hapestumise ja mitokondriaalsete kahjustuste kaudu.NLRP3 põletikuline toime reguleerib negatiivselt makrofaagide fagotsütoosi ja bakteritsiidset toimet Shigella vastu [55].Plasmodiumi uuringud on näidanud, et Plasmodiumiga nakatunud AIM2, NLRP3 või kaspaas-1 puudulikkusega hiired toodavad kõrgel tasemel 1. tüüpi interferooni ja on Plasmodiumi infektsiooni suhtes resistentsemad [56].Alfa-2 giardiini ja alfa-7.3 giardiini roll NLRP3 põletiku patogeense aktivatsiooni esilekutsumisel hiirtel on siiski ebaselge.
Selles uuringus vähendas NLRP3 põletiku inhibeerimine MCC950 poolt hiirte kehamassi ja suurendas trofosoiitide arvu sooleloputusvedelikus, mille tulemuseks olid raskemad patoloogilised muutused kaksteistsõrmiksoole koes.Alfa-2 giardiin ja alfa-7.3 giardiin aktiveerivad peremeeshiire NLRP3 põletikku, suurendavad hiire kehakaalu, vähendavad trofosoiitide arvu sooleloputusvedelikus ja leevendavad patoloogilisi kaksteistsõrmiksoole kahjustusi.Need tulemused viitavad sellele, et G. duodenalis võib aktiveerida NLRP3 peremeespõletiku alfa-2 giardiini ja alfa-7,3 giardiini kaudu, vähendades G. duodenalis'e patogeensust hiirtel.
Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinid kutsuvad esile NLRP3 peremeespõletiku aktivatsiooni ja vähendavad G. duodenalis'e nakkavust hiirtel.Seetõttu on need molekulid paljulubavad sihtmärgid giardiaasi ennetamisel.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiaas: ülevaade.Hiljuti selgus, et Pat Inflamm on ravimite suhtes allergiline.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiaas: farmakoteraapia ülevaade.Proviisori ekspertarvamus.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiaas, ravimiresistentsus ja uute sihtmärkide avastamine.Nakatab Disord ravimi sihtmärke.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T jne NLRP3 põletikulised ja põletikulised haigused.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Põletiku roll soolepõletikus ja vähis.Gastroenteroloogia.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanooniline ja ebatüüpiline NLRP3 põletikuline aktiveerimine immuuntolerantsuse ja soolepõletiku ristteel.eelimmuunne.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S jt.ROS-vahendatud NLRP3 põletikuline aktivatsioon on seotud vastusega N. caninum'i infektsioonile.Parasiitide vektor.2020;13:449.